论文部分内容阅读
背景恶性肿瘤是目前威胁人类生命健康的主要疾病之一,尽管现代医学技术已取得不少突破性进展,但肿瘤患者的生存质量和预后欠佳,亟需寻找有效的分子靶点或生物标志物改善诊断和治疗。肿瘤的发病机制极其复杂,肿瘤的发生通常和参与胚胎发育、细胞增殖分化凋亡相关的基因异常有关,涉及的基因主要包括癌基因和抑癌基因、侵袭转移相关基因和转移抑制基因等。FOXG1属于forkhead-box转录因子家族,是一个在进化上高度保守的winged-helix转录抑制因子,在大脑发育过程中持续高表达,主要通过调节神经细胞的增殖和分化参与端脑和大脑皮层的发育。目前对于FOXG1的研究主要集中在神经系统,而与肿瘤的相关研究较少。已有报道表明,FOXG1的异常表达与胶质母细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肝癌和结直肠癌的发生发展相关,但具体的分子机制和预后价值尚不清楚,本课题通过数据库系统分析FOXG1在不同肿瘤中的表达及临床意义,并构建了人源FOXG1真核表达载体,为进一步研究FOXG1在肿瘤发生发展过程中的作用提供实验基础和理论依据。目的1.基于数据库分析人源FOXG1基因在肿瘤中的表达及临床意义,探讨其作为肿瘤诊断和预后新靶点的价值,为后续的基础研究提供思路。2.构建人源FOXG1真核表达载体,建立FOXG1过表达的稳定细胞株,为研究FOXG1在肿瘤发生发展的生物学功能及其下游调控机制奠定实验基础。方法1.通过Oncomine数据库检索FOXG1在不同肿瘤中的表达谱,进一步meta分析FOXG1在胶质母细胞瘤、浸润性乳腺癌、结直肠癌和肺癌的肿瘤组织和正常组织表达差异;分别检索Kaplan Meier Plotter和GEPIA数据库分析FOXG1在这四种肿瘤中表达的临床意义。2.利用One step cloning方法从p WPXLd-IRES puro-FOXG1上扩增FOXG1,克隆至p EGFP-C1的Eco RI位点,酶切和测序鉴定重组质粒后,通过脂质体瞬时转染Hela细胞,Western blot检测外源FOXG1在Hela细胞中的表达。3.通过慢病毒包装系统共转染HEK 293T细胞,收集的上清液经过滤、离心和浓缩后得到实验组和对照组的病毒原液,经过慢病毒侵染法和嘌呤霉素最佳浓度筛选建立过表达人源FOXG1的A549稳定细胞系。结果1.Oncomine数据库分析显示,FOXG1 m RNA表达水平随肿瘤类型而变化,与正常组织相比,FOXG1在胶质母细胞瘤中显著低表达(P<0.05),而在乳腺癌、结直肠癌和小细胞肺癌中高表达(P<0.05)。FOXG1在肺鳞状细胞癌中低表达(P>0.05)和在肺腺癌中高表达(P>0.05)无统计学意义。2.Kaplan Meier Plotter数据库生存分析发现直肠腺癌患者FOXG1低表达的无复发生存期高于FOXG1高表达(Log-rank P<0.05),FOXG1高表达提示预后不良。FOXG1表达与乳腺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌患者生存预后无相关性(Log-rank P>0.05)。GEPIA数据库生存分析提示FOXG1表达与胶质母细胞瘤患者的生存预后无相关性(Log-rank P>0.05)。3.酶切及测序结果证实,真核表达载体p EGFP-C1成功插入了人源FOXG1基因,重组质粒p EGFP-C1-FOXG1瞬时转染Hela细胞24小时后,倒置荧光显微镜下观察目的蛋白表达,Western blot显示融合蛋白正确表达。4.倒置荧光显微镜下观察病毒包装24小时后,HEK 293T细胞表达绿色荧光蛋白。病毒侵染24小时后,倒置荧光显微镜下观察A549细胞表达绿色荧光蛋白。经过嘌呤霉素筛选,倒置荧光显微镜下观察到A549-FOXG1表达目的蛋白。结论1.FOXG1在胶质母细胞瘤中显著低表达,FOXG1的表达量与胶质瘤患者的总生存期和无复发生存期无显著的相关性。2.FOXG1在浸润性乳腺癌中显著高表达,FOXG1的表达水平与乳腺癌患者的总生存期和无复发生存期无相关性。3.FOXG1在结肠癌中显著高表达,在直肠癌中高表达,直肠腺癌患者的FOXG1高表达提示预后不良。4.FOXG1在肺腺癌和肺鳞癌中的表达与正常组织相比无显著差异,但是在小细胞肺癌中高表达,FOXG1的表达水平与肺腺癌和肺鳞状细胞癌患者的生存预后无显著的相关性。5.成功构建了哺乳动物表达载体p EGFP-C1-FOXG1,实现了FOXG1基因在Hela细胞中瞬时表达。6.慢病毒侵染成功建立了A549-FOXG1和A549-NC稳定细胞株,为后续研究FOXG1基因的生物学功能奠定实验基础。