猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)属于圆环病毒科,作为断奶仔猪多系统衰竭综合征(post-weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原体,目前对其具体致病机制,特别是病毒与宿主细胞之间的相互作用机制的研究相对匮乏。PCV2属于单股负链环状的DNA病毒,其基因组全长约1.7 kb,主要含有3个的开放阅读框(open reading frame,ORF),分别为ORF1、ORF2和ORF3,其中ORF3编码的105 aa的病毒复制非必需蛋白会诱导细胞凋亡。特异性抗体是研究蛋白功能的重要工具。本研究通过构建pET28a-ORF3原核表达载体,获得表达重组ORF3蛋白的基因工程菌,经尿素变性及镍柱纯化的方法得到高纯度的重组ORF3蛋白,通过免疫新西兰大白兔制备获得PCV2 ORF3蛋白的多克隆抗体。制备的多克隆抗体能够特异性结合ORF3蛋白的线性表位,但不能识别ORF3蛋白的构象表位。为探究ORF3蛋白与宿主细胞的相互作用关系,本研究建立稳定表达带有SFB标签的ORF3蛋白的PK-15细胞株。利用串联亲和纯化联合质谱分析的方法,筛选到33个与ORF3蛋白相互作用的细胞蛋白,分别涉及细胞骨架、分子伴侣、能量代谢等。经免疫共沉淀和亚细胞共定位技术验证,分子伴侣CCT5蛋白与ORF3蛋白存在特异性相互作用。本研究通过串联亲和纯化联合质谱发现并鉴定到一个ORF3蛋白的互作蛋白CCT5,为深入研究ORF3蛋白及其互作蛋白在PCV2的病毒复制及致病机制中的作用奠定基础。