研究目的： 1．应用蛋白双向电泳技术，摸索人血浆蛋白双向电泳分离技术和条件，建立和优化人血浆蛋白标准电泳图谱； 2．以标准人血浆蛋白双向电泳条件及参数为依据，对正常人群及原发性股骨头无菌性坏死患者的血浆蛋白电泳图谱进行配对分析比较，寻找差异蛋白质点；应用质谱鉴定技术，对差异蛋白质点进行鉴定；应用Western Blot技术对所鉴定的蛋白质进行验证；经生物信息学检索，分析所鉴定的蛋白质在原发性股骨头无菌性坏死病理机制中的作用，从而确立原发性股骨头无菌性坏死血浆疾病相关蛋白质； 3．应用受试者工作特征分析法，对所鉴定的蛋白质在原发性股骨头无菌性坏死血浆临床诊断实验中的作用进行初步评价，为其进一步临床检验的应用提供参考依据，同时为今后原发性股骨头无菌性坏死的治疗及各种治疗手段的血浆学疗效评估奠定基础。 材料与方法： 采用Amersham Biosciences公司IPGphor IEF System进行等电聚焦、the EttanDALT Ⅱ system进行垂直电泳；Imagescanner LabScan software进行电泳图像采集，ImageMaster 2D Elite进行图像分析；应用美国应用生物系统公司(ABI)protein sequencer(MALDI-TOF MS)进行质谱鉴定，Mascot软件检索SWISS-PROT数据库同时行蛋白质生物信息学分析；在Western Blot过程中，应用Bio-Rad湿式电转仪进行转膜，经封闭、一抗孵育、二抗孵育及蛋白检测等过程，对所鉴定的蛋白质进行验证；应用ELISA法对所鉴定的蛋白质在原发性股骨头无菌性坏死(idiopathic osteonecrosis of the femoral head ONFH)临床血浆检验中的应用进行受试者工作特征(Receiver Operating Characteristic ROC)分析。所有血浆标本均在受检者本人或其家属的知情同意下获取。 1、晨起空腹条件下采集健康志愿者静脉血2ml，离心后收集血浆，Bradford法测定蛋白浓度；按Amersham Bioscienses公司Albumin/IgG Remove kit试剂盒的操作说明去除血浆白蛋白和IgG；向上述已去除白蛋白和IgG的滤液中加入4倍体积的冰丙酮，-20℃孵育，2h以上(或过夜)；-4℃ 13000g离心10-20min；弃去丙酮，用干净的滤纸吸去丙酮液滴，于超净台中风干：在处理好的样品中加入相应IPG胶条所需的溶胀液，混匀至少30S，室温孵育至全部溶解；以12000g速度离心，5min，以除去杂质和泡沫；根据所选用IPG胶条pH及长度的不同，选用不同的IPG泡胀槽(IPG Holder)；在泡胀槽阳极附近均匀加入不同浓度的上样液；将IPG胶条置入胶条槽进行溶胀；结束溶胀后设置不同的IPGphor仪器运行参数进行等电聚焦；结束后从泡胀槽中取出胶条，进行两次震荡平衡各10min。预灌制好SDS-PAGE胶后，将平衡好的IPG胶条置于SDS胶面上，低熔点0.5﹪琼脂糖封胶，设定电泳条件进行垂直聚焦，直至溴酚蓝达胶底线。电泳结束后，对凝胶进行考马斯亮蓝染色及硝酸银染色；凝胶用图像扫描仪扫描，分析上述不同的电泳条件对凝胶图像的影响，从而选择出最优化的电泳条件，建立人血浆标准双向电泳图谱。 2、以上述标准人血浆蛋白双向电泳条件及参数为依据，分别采集正常人群及ONFH患者的外周静脉血，离心获取血浆后分别于相同条件下行蛋白双向电泳，标准化各自图谱后进行配对分析比较，寻找差异蛋白质点；应用质谱鉴定技术，获取差异蛋白质点的肽谱图等信息，Mascot软件检索SWISS-PROT数据库对差异蛋白质点进行鉴定，应用Western Blot法对所鉴定的蛋白质进行验证，从而确立ONFH血浆相关疾病蛋白。经生物信息学分析，阐述上述所鉴定的疾病相关蛋白质在ONFH疾病病理机制中的可能作用。 3、应用酶联免疫吸附实验(ELISA)对上述所鉴定的蛋白质在ONFH诊断实验中的作用进行ROC分析，初步评价各差异蛋白质诊断的敏感性、特异性及符合率等指标。 结果： 1、经过对血浆白蛋白和IgG的去除、IPG胶条的选择、蛋白上样量、等电聚焦参数、平衡条件、两向之间的转移、SDS-聚丙烯酰胺凝胶的浓度、垂直电泳以及凝胶染色等血浆蛋白质双向凝胶电泳的关键步骤进行优化，建立了可重复、稳定性好以及蛋白质分离效果好的血浆蛋白质2-DE标准图谱及其技术。 2、比较正常人群及ONFH患者的血浆2-DE图谱，发现二者之间存在7个差异蛋白质点，其中3个蛋白质点在ONFH患者的血浆图谱中显著升高，而另外4个差异蛋白质点显著降低。经质谱鉴定，升高的3个蛋白质点分别为PAI-1、crosslaps以及anti-p53 antibody，降低的4个蛋白质点有3个得到了鉴定，分别是t-PA， BGP和c-sis，而另一蛋白质点未能确定，其分子量为9.82kDa，pI为5.64，可能是一新的蛋白质。经western Blot验证，证实上述所鉴定的差异蛋白质点的鉴定结果可信。 3、经生物信息学检索，发现所鉴定的6个差异蛋白质与血液凝血异常、原癌基因及抑癌基因调空失衡导致的细胞凋亡异常、成骨细胞活动下降导致的BGP合成和分泌减少以及骨基质-Ⅰ型胶原代谢异常有关，提示这6种蛋白质在ONFH的病理机制中起着非常重要的作用。另一未能鉴定的差异蛋白质在其中的作用有待今后进一步研究。 4、差异蛋白质ROC分析过程中发现，PAI-1、crosslaps、anti-p53 antibody以及t-PA在原发性股骨头无菌性坏死患者与非ONFH人群的静脉血中的含量始终存在显著的差异，而BGP及c-sis却无统计学差异。PAI-1、crosslaps以及t-PA的特异性，敏感性及符合率都在70﹪以上，有一定的诊断意义，p53 antibody诊断意义其次，而BGP和c-sis则基本价值不大。 结论 1、采用优化的双向凝胶电泳技术可成功建立血浆蛋白质组学研究方法，该方法的确立为寻找血浆疾病相关蛋白质奠定了基础。 2、ONFH与正常人群在血浆蛋白表达谱之间存在差异。其中PAI-1、crosslaps以及anti-p53 antibody在ONFH血浆中的表达升高，而蛋白质t-PA， BGP和c-sis在ONFH血浆中的表达下调。 3、差异蛋白质的存在提示ONFH的病理机制与血液凝血异常、原癌基因及抑癌基因调空失衡导致的细胞凋亡异常、成骨细胞活动下降导致的BGP合成和分泌减少以及骨基质-Ⅰ型胶原代谢异常有关。 4、PAI-1、crosslaps、anti-p53 antibody以及t-PA作为潜在的ONFH血浆疾病标记物，可为今后ONFH的血浆学诊断、治疗以及各种治疗手段疗效的评估提供参考依据。