恶性血液肿瘤主要包括白血病,骨髓瘤和淋巴瘤,是威胁全世界人类健康的主要恶性肿瘤之一,尽管新的研究技术和手段为血液肿瘤的治疗带来了希望,但是其发病率和死亡率仍然很高,尤其是白血病和MM。OVV疗法目前成为新型的抗肿瘤疗法之一,其不仅能凭其溶瘤效应激发体内的免疫应答,还能作为基因治疗工具介导外源治疗性基因的表达并发挥抗肿瘤效果。本课题分为两部分,第一部分是携带miR-34a和携带Smac的溶瘤痘苗病毒联合治疗多发性骨髓瘤的研究。第二部分是溶瘤痘苗病毒介导的Beclin-1基因过表达诱导的自噬对血液肿瘤的增殖抑制作用的研究。第一部分:携带miR-34a和携带Smac的溶痏痘苗病毒联合治疗多发性骨髄瘤的研究目的:构建携带miR-34a基因的溶瘤痘苗病毒OVV-miR-34a并研究它与OVV-Smac联合抑制MM细胞的增殖作用及其相关机制。方法:采用基因工程技术构建OVV-miR-34a;通过荧光显微镜和FACS技术检测OWs对MM细胞的感染效率;利用MTT法检测对照病毒OVV,OVV-miR-34a,OVV-Smac及双病毒联合对MM细胞株的体外生长抑制作用,同时感染正常细胞株和人正常原代细胞株检测OVVs的安全性;采用Real-time PCR和Western blot技术检测OVVs体外表达miR-34a和Smac的能力,以及对miR-34a的靶基因和Smac下游蛋白的调控;通过Wersterm blot和Annexin V/PI双染检测OVVs感染MM细胞后,是否有细胞凋亡的诱导和caspase信号通路激活;采用激光共聚焦显微镜观察Cytochrome c从线粒体内膜释放到胞浆的过程;构建RPMI-8226荷瘤裸鼠模型并瘤内注射OVVs,检测不同OVVs在体内抗肿瘤效果;组织病理学检测OVV-miR-34a与OVV-Smac体内抗肿瘤机制。结果:(1)成功构建出携带目的基因且而无野生型病毒污染的重组OVV-miR-34a。(2)OVV-GFP在MM细胞株RPMI-8226和U266的感染效率在48h,8MOI时高达49.28%和59.1%。(3)MTT检测结果显示相对于OVV-miR-34a和OVV-Samc单病毒使用,双病毒联合抑制MM细胞增殖的效果更强,且具有协同作用,同时对正常细胞株和原代细胞安全。(4)体外感染OVV-miR-34a和OVV-Smac后,目的基因miR-34a和Smac在mRNA和蛋白水平上都有高水平的增强表达,同时miR-34a的靶基因Bcl-2和SIRT1也都随着miR-34a的增强表达而下调且呈浓度依赖性。相对于miR-34a mimics而言,OVV-miR-34a表达miR-34a和下调Bcl-2的能力更显著,证明OVV可以作为一个良好的mircroRNA体外表达工具。同时,Smac下游的信号通路c-IAP/XIAP因OVV-Smac作用呈相应下调和被抑制。(5)OVVs感染MM细胞后,双病毒联合诱导的细胞凋亡率达58.1%左右,同时伴有PARP-1,caspase-9,caspase-3等凋亡蛋白的激活和剪切。激光共聚焦显微镜观察结果显示OVV-miR-34a与OVV-Smac联合作用能引起较强烈的Cytochrome c从线粒体内膜向胞浆释放。(6)体内抗肿瘤实验结果显示OVV-miR-34a与OVV-Smac联合作用能抑制RPMI-8226荷瘤裸鼠的肿瘤生长与延长小鼠的生存期,病理组织学检测结果证明双病毒联合能引起强烈的细胞凋亡,抑制血管的增生。结论:本课题成功构建新型的溶瘤痘苗病毒OVV-miR-34a,并从体外、体内多重方向上研究它与OVV-Smac联合抗骨髓瘤细胞生长的作用及其内在机制。本研究首次将OVV疗法与miRNA联合治疗MM,为进一步拓展OVV的临床研究领域奠定基础。第二部分 溶瘤痘苗病毒介导的Beclin-1基因过表达诱导的自噬对白血病和骨髓瘤细胞增殖的抑制作用的研究目的:构建新型的溶瘤痘苗病毒OW-Beclin1,并研究其诱导血液肿瘤细胞发生自噬性死亡途径及抑制血液肿瘤细胞增殖的效应。方法:采用基因工程技术构建携带自噬诱导基因Beclin1的新型溶瘤痘苗病毒OVV-Beclin1。利用OVV-GFP感染白血病细胞株HL-60和K562检测OVVs对白血病细胞的感染效率。采用免疫荧光染色技术(IP)以内质网标记蛋白Calreticulin作为内参,运用激光共聚焦显微镜观察经OW增强表达的Beclin1在细胞质内的亚定位。通过Real-time PCR和Western blot技术检测目的基因Beclin1在mRNA和蛋白水平上的增强表达。利用MTT法检测OVV和OVV-Beclin1对白血病和MM细胞株体外生长抑制作用,同时感染正常细胞株和人正常原代细胞检测OVVs的安全性。通过以下实验检测OVV-Belcin1能否诱导细胞凋亡发生:(1)通过 Western blot 检测 OVV-Beclin1 感染细胞后是否激活 caspase-3,caspase-9,PARP-1的剪切;(2)利用Annexin V/PI双染实验检测OW-Beclin1感染后凋亡率的变化;(3)联合pan-caspase抑制剂Z-LEHD-FMK以及构建caspase-3 shRNA的耐凋亡细胞株进一步检测OVV-Beclin1能否诱导细胞凋亡发生。通过以下实验验证OVV-Beclin1能否诱导自噬性细胞死亡:(1)联合自噬抑制剂和自噬激活剂检测OVV-Belcin1对细胞存活率的影响;(2)利用Western blot检测自噬相关蛋白p62,LC3Ⅰ/Ⅱ的变化;(3)采用AO和MDC染色方法检测OVV-Beclin1诱导细胞浆中酸性小体的形成;(4)通过IF检测内源LC3或者外源转染Ad-mRFP-GFP-LC3检测OVV-Beclin1引起的LC3在细胞胞浆中聚集,自噬小体以及自噬溶酶体的形成;(5)通过TEM观察OVV-Beclin1诱导细胞发生自噬后自噬囊泡的形成。进一步探讨OVV-Beclin1诱导自噬性细胞死亡的潜在机制:(1)利用Real-time PCR,Western blot检测OVV-Beclin1诱导的自噬与SIRT1的关系;(2)激光共聚焦显微镜观察SIRT1的活性与LC3核转出的关系;(3)通过免疫共沉淀(Co-IP)检测OVV-Beclin1激活的SIRT1与LC3乙酰化的关系。构建K562-luciferase Nod-SCID全身白血病小鼠模型并腹腔注射相应的OVVs验证OVV-Beclin-1体内抑制白血病细胞增殖,延长小鼠的生存率的能力。结果:(1)通过基因重组,测序鉴定,空斑筛选和多轮药物筛选,成功构建出携带目的基因Beclin1而无野生型病毒污染的重组OVV-Beclin1。(2)荧光显微镜和FACS检测OVV-GFP在白血病细胞株HL-60和K562的感染效率48h时在20 MOI时分别为44.92%和51.85%。(3)IF实验和激光共聚焦显微镜观察证明OW表达的Beclin1亚定位于内质网上。(4)MTT实验结果证明OVV,OVV-Beclin1能选择特异性杀伤白血病和骨髄瘤细胞株,而对正常细胞株安全。(5)Real-timePCR和Western Blot证明OVV-Beclin1呈时间和浓度依赖性增强表迖Beclin1。(6)凋亡相关实验证明OVV-Beclin1主要不是通过诱导细胞凋亡的方式诱导白血病和骨髓瘤细胞死亡。(7)自噬相关实验证明OVV-Beclin1能够诱导自噬的发生,调节自噬相关基因p62和LC3Ⅰ/Ⅱ的变化,诱导自噬小体和自噬溶酶体的形成。(8)进一步的 Real-time PCR,Western blot 和 Co-IP 证明 OVV-Beclin1 激活 SIRT1 的组蛋白去乙酰化酶的活性,降低LC3的乙酰化水平,促使LC3从细胞核转移到胞浆,最终参与自噬小体的形成,诱导自噬的发生。(9)体内K562-luciferase Nod-SCID小鼠模型实验证明OVV-Beclin-1能有效抑制白血病细胞增殖,延长小鼠的生存率。结论:本课题成功构建了新型的溶瘤痘苗病毒OVV-Beclin1。体外、体内实验结果证明OVV-Beclin1能有效地诱导自噬性细胞死亡途径,并抑制血液肿瘤细胞,包括白血病和MM的增殖。本课题首次将OW治疗策略与自噬性细胞死亡相结合治疗血液肿瘤,为溶瘤病毒治疗恶性血液肿瘤的临床研究提供理论基础。