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受精卵原核显微注射是目前常用于转基因小鼠制作的技术方法，该技术对于多种基因功能的快速分析至关重要。本研究针对原核注射制备转基因动物的关键环节进行了系统研究，利用ApaL I和Mlu I对质粒pEGFP-C1进行双酶切得到的含CMV启动子和EGFP编码区的DNA片段进行原核注射，然后将正常卵裂且表达EGFP的2-细胞胚胎经输卵管壁穿刺进行胚胎移植，得到46只新生仔鼠，其中11只为转基因阳性。初步建立了制作转基因小鼠的受精卵原核显微注射技术平台。同时，应用激光扫描共聚焦显微镜，结合免疫荧光技术对原核注射后昆白小鼠受精卵到第一次有丝分裂过程中微管和微丝进行了定位观察，以分析原核注射对小鼠受精卵及早期发育过程中细胞骨架系统的影响。对原核注射后昆白小鼠受精卵到第一次有丝分裂过程中纺锤体组装相关细胞骨架结构进行研究，并应用实时荧光定量PCR和Western blotting对细胞骨架相关调控基因和蛋白的相对表达量进行了分析。研究工作内容及研究结果为：1．原核注射法制备转EGFP基因小鼠采用DBA/2公鼠与C57/BL6母鼠交配获得的B6D2F1为供卵母鼠，供卵母鼠超排后与B6D2F1公鼠交配获得B6D2F2受精卵供原核注射。共注射859枚受精卵，注射后645枚受精卵存活，存活率75.09%；继续培养24h后有512枚胚胎发育至2-细胞，胚胎卵裂率为78.04％。将其中124枚2-细胞胚胎继续进行体外培养，最终得到70枚囊胚，囊胚发育率45.45%；胚胎荧光观察发现，EGFP目的基因在原核注射卵发育到2-细胞、4-细胞、桑椹胚和囊胚时均有表达。将另外388枚2-细胞胚胎移植到20只假孕ICR母鼠的输卵管壶腹部，19~21d后确定有6只母鼠妊娠，妊娠率为30％；获得46只子代（包括移植后21d仍未分娩的1只母鼠剖宫获得的9只仔鼠），产仔率为11.86%；PCR鉴定有11只整合有EGFP目的基因，转基因整合率为23.91%。2．昆白小鼠受精卵原核注射后微管和微丝的动态变化昆白小鼠受精卵原核注射后微管和微丝的动态变化研究结果显示，原核注射对受精卵微管网络的影响主要集中在原核期和有丝分裂的前、中期，与原核注射损伤修复及纺锤体组装相关；而对微丝网络的影响主要集中在在第一次有丝分裂开始前，并且对于受精卵皮质区域的微丝分布没有显著影响；3．昆白小鼠受精卵原核注射后纺锤体相关细胞骨架结构的动态变化昆白小鼠受精卵原核注射后纺锤体相关细胞骨架结构的动态变化研究结果表明：原核注射胚胎中α-微管和微丝的重组可能与原核注射操作对原核损伤的修复有关，而γ-微管则与纺锤体的极性组装有关；并且通过Tpx2和AuroraA共同维持原核注射胚胎中有丝分裂纺锤体微管的正确组装和两极分离，Aurora B则可能是与维持原核注射胚胎的正常胞质分裂有关。