背景与目的胶质母细胞瘤（glioblastoma,GBM）是常见并且致命的中枢性神经系统原发性脑肿瘤。GBM按照病理类型可分为三种类型,间叶型（MES）、经典型（CL）和前神经型（PN）。其中MES得亚型最具侵袭性和放射抵抗力,与不良预后相关。但是目前得研究显示MES分化的内在分子机制仍很不清楚。活化T细胞核因子（NFAT）为T细胞中的转录因子,可通过与组蛋白去乙酰化酶（HDAC）和核因子NF-κB途径相互作用,调节炎症反应和免疫应答研究表明。NFAT家族分子在肿瘤的起始阶段、发展阶段中也起重要作用。NFAT2别名NFATC1,过去研究显示与获得干细胞特性、自我更新能力和促进肿瘤细胞上皮向间充质转化（EMT）有关,而EMT和干性的获得可以使癌细胞变得高度侵袭,并导致肿瘤转移、治疗耐药和复发。最近研究表明,在结肠癌、胰腺癌和乳腺癌中发现NFAT2信号的异常激活,NFAT2在不同的肿瘤中具有不同的功能。本研究着眼于NFAT2在细胞水平和动物水平对胶质瘤干细胞（Glioma stem cell,GSCs）得干性、增殖、侵袭能力的影响,并在细胞水平探讨了NFAT2的下游靶点及其作用机制。研究方法1.伦理审查:本研究由中国医科大学第一医院机构评审委员会批准（批准号81472360）。所有动物实验均受中国医科大学动物伦理委员会监督（批准号2019092）。2.GSCs培养新鲜切除的临床胶质瘤组织分离成单细胞,饲养在5%CO2,37摄氏度的孵箱中添加干细胞培养基培养成胶质瘤干细胞。3.转染质粒、慢病毒载体的NFAT2、HDAC1的对照和shRNA用于沉默。质粒、慢病毒载体的NFAT2、HDAC1的cDNA用于过表达。WB检测基因沉默和过表达的效果。4.免疫组织化学（IHC）取胶质瘤组织石蜡包埋切片用抗NFAT2和CD44的抗体进行免疫组织化学染色。光学显微镜下观察并拍照。5.免疫印迹分析经提蛋白,蛋白定量,电泳,转膜,牛奶封闭,一抗,二抗,发光仪发光等步骤进行western bolt。NFAT2、YKL40、CD44、OLIG2、HDAC1、NF-κB p65、抗乙酰赖氨酸抗体用于检测相应蛋白质表达。经用Image J软件定量。6.免疫荧光细胞经多聚甲醛固定,Triton X-100通透,3%BSA封闭,一抗4℃过夜,荧光二抗1h后荧光显微镜下观察。CD133、CD44、nestin、GFAP、β-Ⅲtublin、NFAT2、HDAC1抗体用于免疫荧光实验检测相应蛋白的定位和表达情况。7.q-PCR使用柱式RNA提取试剂提取总RNA,Prime-Script RT Master Mix合成单链cDNA,然后用SYBR Green Master Mix进行qPCR检测。每个样品分3次重复运行,以β-actin作为内对照。2-ΔΔCt方法用于计算表达相对倍数。8.极限稀释神经球形成试验:神经干细胞的自我更新能力是通过神经球形成实验来评估的,神经球被解离并以每孔50、100、500或1000个细胞的速度种植到96孔板中。7d后观察球体大小,并计数直径大于50μm的球体。9.球体立体侵袭将神经球被嵌入到由基底膜蛋白组成的侵袭基质中,在96孔板中培养侵袭。在0h和48h拍摄侵袭距离表示侵袭能力,并用Image J进行定量。10.细胞活力测定使用96孔板按照细胞增殖分析试剂盒检测细胞存活率,每0.2.4.6天测细胞活力并绘制曲线。11.Transwell将GSC细胞球做成单细胞悬液放入上室,下室放入10%血清使其侵入涂有Matrigel的滤膜20h。用显微镜拍摄侵袭细胞,并用Image J软件计数。12.TUNEL法使用TUNEL试剂盒检测凋亡,细胞经多聚甲醛固定,Triton X-100通透,避光3%H2O2封闭后,在37℃用TUNEL溶液孵育90分钟。DAPI用于染色细胞核。在荧光显微镜观察样品并取图计算凋亡率。13.荧光素酶活性分析Jaspar网站生物信息学预测HDAC1启动子区域转录起始点上游的312-812个碱基对的NFAT2结合位点。将具有结合位点为野生型和突变型得NF-κB和HDAC1启动子区域克隆到荧光素酶载体片段上。使用Promega双荧光素酶报告试剂盒检测转染质粒的荧光素酶活性。14.颅内胶质瘤原位移植用立体定向仪将转染的GSCs注射到麻醉雌性BALB/c裸鼠体内。观察小鼠症状和生存期,并评估肿瘤生长情况。收集小鼠的大脑进行分析,HE染色评估肿瘤大小。15.统计分析。所有实验至少重复三次,数据以平均值±标准差表示。组间比较采用卡方检验、t检验或方差分析。通过Glio Vis在线平台访问和处理TCGA肿瘤基因组图谱数据库、美国国家癌症研究所分子脑肿瘤数据库（REMBRANDT数据库）。生存差异采用logrank检验和Kaplan-Meier分析。用Pearson相关分析NFAT2与HDAC1表达的关系。采用基因集富集分析GSEA检测NF-κB通路信号的不同富集程度。双尾P值<0.05被认为具有统计学意义。使用SPSSv19.0软件进行统计分析。结果1.NFAT2在MES型GBM中上调,并与存活率呈负相关NFAT2的表达在IV级胶质瘤、MES亚型、复发的GBM中的高表达。高表达的NFAT2在全体胶质瘤和MES亚型的胶质瘤中与不良预后显著相关。NFAT2蛋白水平与MES标志物YKL40和CD44呈正相关,与PN标记OLIG2呈负相关。CD44阳性亚组的GSCs中NFAT2的表达较高。2.NFAT2沉默抑制MES-GSC富含肿瘤球体的体外生长沉默NFAT2导致CD44和YKL40表达下降。细胞增殖能力,抗凋亡能力在NFAT2基因敲除后被显著抑制。NFAT2表达的沉默降低了胶质瘤干细胞群体的侵袭能力。NFAT2基因敲除的GSC球体大小显著减小。3.NFAT2表达上调可以在细胞水平促进胶质瘤干细胞GSCs的MES转化和生长。NFAT2过表达增加CD44和YKL40的表达,提示MES分化。NFAT2基因表达增加导致细胞增殖能力显著上调和抗凋亡能力明显上升。NFAT2的过表达显著促进了细胞的侵袭,促进了GSCs球体的生长,并导致球体大小显著增加和球体形成。4.NFAT2对GSCs体内致瘤性和MES分化的影响沉默/过表达NFAT2显著抑制/增加了GSCs的颅内肿瘤生长,延长/缩短了肿瘤模型的存活时间。体内肿瘤的IHC显示,NFAT2基因敲除/过表达显著降低/增加体内肿瘤表达的CD44水平。5.NFAT2对GSCs中HDAC1表达的调控在TCGA数据库中胶质瘤mRNA数据库中,NFAT2的表达与HDAC1的表达显著相关。HDAC1在MES亚型、复发的GBMs中的显著上调,与MES标志物CD44和YKL40的表达呈正相关,HDAC1高表达与胶质瘤和胶质瘤中较差的存活率有关。与NFAT2具有相似性,在CD44表达阳性的GSCs中HDAC1的表达高于CD44表达阴性的GSCs。NFAT2表达沉默后HDAC1的表达同样被抑制了。由此可以得出结论NFAT2可以正向调控HDAC1表达。NFAT2沉默/过表达显著降低/增加带有野生型启动子的G08 GSCs的荧光素酶活性,而突变型无任何改变。HDAC1的缺失显著降低了CD44和YKL40的表达,抑制了增殖、侵袭、自我更新能力并诱导了细胞凋亡。6.在NFAT2稳定敲除的GSCs中挽救HDAC1的表达可恢复体内生长能力。在NFAT2沉默的GSC中稳定地重新表达HDAC1,导致CD44、YKL40恢复表达;细胞增殖,侵袭,自我更新能力、体内肿瘤的生长、体内肿瘤的CD44表达部分恢复。7.NFAT2-HDAC1信号调节NF-κB途径活性。胶质瘤干细胞GSCs的NFAT2表达沉默后NF-KB的p65亚基的赖氨酸残基的乙酰化程度增加。在使用由NF-κB结合位点控制的荧光素酶报告的转录分析中,NFAT2沉默抑制了NF-κB的活性。然而,在GSC中NFAT2基因敲除后再挽救HDAC1的表达可以恢复已经被抑制了p65的超乙酰化,并恢复了NF-κB依赖的转录活性。结论NFAT2通过调节HDAC1表达可以调节NF-κB的乙酰化状态,去除NF-κB过度乙酰化可以使其保持持续活化状态进而维持GBM的恶性表型。因此靶向抑制NFAT2/HDAC1/NF-κB轴可能是是治疗GBMS,尤其是MES亚型的一种有吸引力的治疗方法。