论文部分内容阅读
目的：选取5个急性髓系白血病(AML)相关基因,对新诊断的中国和欧洲血统占主要优势的西方AML患者进行基因突变差异比较。研究BCL11A在中国AML患者中的表达水平。对BCL11A上游调控机制进行深入研究,包括转录起始位点鉴定,启动子活性分析,髓系分化关键调控因子CEBPa在BCL11A启动子上结合位点的鉴定以及CEBPa对BCL11A的转录调控研究。进一步探讨BCL11A在白血病发生过程中起到的致癌基因作用。方法：(1) 收集AML患者骨髓样本269例,PCR扩增NF1,TP53,NRAS, FLT3, DNMT3A5个AML相关基因并进行测序鉴定,分析鉴定其突变情况。(2)TaqMan探针实时荧光定量方法,精确定量AML患者中BCL11A的表达水平,并与12例正常人骨髓样本进行比较,分析其表达是否失调。(3) 生物信息学分析及5’-RACE方法对BCL11A转录起始位点进行鉴定。(4) 构建MBCL11A启动子及启动子系列缺失体,通过双荧光素酶报告基因系统分析启动子活性。对活性显著的启动子再次进行生物信息学分析,分析其可能的转录因子结合位点。(5) 通过构建CEBPA相关表达载体,与BCL11A启动子共转染,CEBPA突变,启动子结合位点突变等实验鉴定CEBPa对BCL11A启动子活性的影响。(6)通过过表达CEBPA实验验证其对内源BCL11A表达的影响。(7) 构建HL-60细胞分化模型,通过分化等实验来研究ATRA诱导HL-60髓系分化过程中BCL11A所起的作用。结果：(1) NF1, TP53, DNMT3A, NRAS, FLT3在中国AML患者中的突变频率分别为0,<1%,6%,7%,23%。且这5个基因突变与临床特征包括年龄、性别、FAB-type和细胞遗传学等没有显著的联系。除FLT3-ITD外,其余四个基因在中国AML患者中的突变频率均低于欧洲血统占主要优势的西方AML患者。(2) BCL11A在中国AML患者中表达失调,表现出一定的高表达。(3) 5’-RACE实验发现BCL11A存在新转录起始位点,在NCBI公布的转录起始位点基础上继续向上游延伸142bp。(4) BCL11A新转录起始位点上游500bp碱基序列具有显著的启动子活性。(5) 转录因子CEBPα抑制BCL11A启动子活性,且抑制作用随着CEBPA表达时间的延长和表达量的增加而加深。CEBPA基因突变后,抑制作用消失。对BCL11A启动子上CEBPα可能的结合位点进行定点突变后,BCL11A启动子活性上升约40%。(6) CEBPA过表达抑制内源BCL11A表达。(7)HL-60细胞分化过程中,CEBPA表达水平上升,BCL11A表达水平降低,两者呈现负相关。而过表达BCL11A则会抑制HL-60细胞分化。结论：本研究发现与西方研究相比,AML发生密切相关的基因在中国AML患者中突变频率普遍偏低,提示在中国AML的发生发展中可能有其他基因通过其他尚未被发现的机制起作用。首次发现BCL11A在中国AML患者中表达失调。并在随后的BCL11A分子遗传调控网络研究中鉴定了新的BCL11A转录起始位点,还首次发现髓系分化过程中关键的调控因子CEBPα可能作为一个主要的转录因子抑制BCL11A的表达,并且抑制作用随着CEBPA表达时间的延长和表达量的增加而加深。HL-60细胞分化过程中,内源CEBPA表达上升并抑制内源BCL11A的表达,两者呈现负相关,并且BCL11A高表达会抑制HL-60细胞分化。提示BCL11A的表达下调是介导CEBPα诱导髓系分化的重要事件。为进一步证实BCL11A在白血病发生过程中起到致癌基因作用打下坚实的基础。