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骨质疏松症(Osteoporosis,OP)是一种常见于中年妇女和老年人群的代谢性骨病,它越来越威胁着患者的健康。除导致骨痛、颈腰椎变形、身高变矮、驼背和肺功能降低外,还因为破坏骨的微细结构、增加骨骼脆性而特别容易引起骨折,这种类型的骨折的难以治疗、死亡率高,致残率高,给患者及其家属带来沉重的精神压力和经济负担。目前,对骨质疏松症没有理想的治疗方法,临床上主要采用药物治疗,常用药有双磷酸盐、降钙素类等,因其价格昂贵、长期服用的副作用大等缺点,人们一直在努力寻找替代疗法,其中电磁场疗法是当今研究的热点之一。低频脉冲电磁场(Pulsed electromagnetic field,PEMFs)具有无创伤、操作简单、价格低廉等优点,但其作用机制至今不明,且因治疗参数的“生物窗效应”而导致疗效的重复性差,大大限制了其推广应用”。本论文在课题组已筛选确定一组最佳PEMFs参数组合(50 Hz、0.6 mT、50%占空比)并发现PEMFs促进骨形成活性需要初级纤毛参与的基础上,进一步研究发现,PEMFs通过初级纤毛调控的IGF-1R/PI3K/AKT/NO信号通路促进骨形成。所采用的主要方法、结果及结论如下。实验方法:1.从新生大鼠颅骨提取分离和培养成骨细胞(ROBs);2.用最佳参数组合的PEMFs处理ROBs不同时间后,检测碱性磷酸酶(ALP)活性、IGF-1R表达量、以及一氧化氮(NO)含量等;3.分别利用IGF-1R阻断剂GSK和PI3K的阻断剂BEZ预处理ROBs,分析PEMFs促进骨形成活性改变情况;4.信号蛋白与初级纤毛共定位研究;5.干扰初级纤毛发生,分析PEMFs对促进骨形成和激活IGF-1R相关信号通路的影响。实验结果:1.采用最佳参数PEMFs处理ROBs不同时间后检测IGF-1R的蛋白表达量,发现0、0.5、1、1.5h后蛋白表达量逐渐增加,1.5h时达到峰值,并显著高于0h(P<0.01)的表达量,此后的2、2.5、3、3.5和4hIGF-1R表达量持续下降。2.用IGF-1R阻断剂GSK预处理ROBs后,PEMFs促进成骨细胞矿化和成熟活性受到显著抑制,表现为加阻断剂组的碱性磷酸酶活性(ALP)活性显著低于PEMFs组(P<0.01),ALP染色阳性克隆的数量和面积减少,钙化结节的数量和面积呈相同变化。表明抑制IGF-1R可以拮抗PEMFs促进成骨细胞矿化成熟的能力。3.用免疫荧光染色法进行IGF-1R和初级纤毛的共定位研究,发现IGF-1R分布于初级纤毛各个部位。通过RNA干扰法抑制初级纤毛后,PEMFs促进成骨细胞矿化和成熟活性明显下降,同时PEMFs提高IGF-1R表达的影响也消失,表明IGF-1R的表达水平受到初级纤毛的调控。4.用GSK预处理ROBs后,PEMFs提高PI3K和AKT的表达量及其磷酸化水平的作用明显减弱(P<0.05),表明PI3K/AKT信号通路位于IGF-1R的下游。同时还发现,用GSK阻断IGF-1R后,NO信号途径也受到抑制,表明NO信号途径也位于IGF-1R的下游。5.用不同浓度的BEZ预处理ROBs以筛选BEZ抑制PI3K的最佳位点,结果显示ATR位点的抑制作用最显著。用ATR浓度预处理ROBs后,ALP活性、ALP染色阳性克隆和钙化结节数均明显下降,同时eNOS、iNOS和PKG的表达量也受到明显抑制,表明NO信号途径位于PI3K/AKT的下游。以上研究结果表明,50 Hz 0.6 mT PEMFs可以通过激活IGF-1R信号途径而显著促进大鼠颅骨成骨细胞的成骨性分化和矿化成熟,其中IGF-1R定位于初级纤毛根部,并且其表达水平受到初级纤毛的调控,PI3K/AKT信号途径位于IGF-1R的下游,NO信号途径又位于PI3K/AKT的下游,故PEMFs是通过激活初级纤毛调控的IGF-1R/PI3K/AKT/NO信号途径促进骨形成的。本研究为进一步筛选PEMFs最佳治疗参数,提高PEMFs的临床疗效提供了实验依据。