热稳定性差和催化活性低是当前饲用内切葡聚糖酶生产和应用的瓶颈。本研究着眼于提高酶活较高基因的耐热性,以瘤胃真菌(Piromyces rhizinflata2301)和耐热丝状真菌总状共头霉(Syncephalastrum racemosum BCC18080)为亲本,将瘤胃真菌内切葡聚糖酶的高活性片段和总状共头霉内切葡聚糖酶的耐热片段进行拼接,设计出一种新的杂合内切葡聚糖酶基因,合成全基因后用大肠杆菌和家蚕BmNPV/Bac-to-Bac两种表达系统生产既耐热又在生理温度下酶活高的杂合内切萄聚糖酶,系统研究比较了杂合内切葡聚糖酶及其亲本酶的酶学性质。1.里氏本霉内切葡聚糖酶Ⅱ基因在BmNPV/Bac-te-Bac快速基因表达系统中的探索性表达　　 采用RT-PCR方法克隆了里氏木霉QM9414内切-β-葡聚糖酶Ⅱ基因的cDNA编码序列(egl2),利用家蚕BmNPV/Bac-to-Bac快速基因表达系统,在细菌转座子的作用下将EGⅡ基因整合到家蚕核型多角体病毒(BmNPV)基因组中,从而产生重组病毒。利用该重组病毒感染家蚕BmN培养细胞以及家蚕五龄幼虫,推算得出每只幼虫能够生产大约386μg重组内切葡聚糖酶,纯化蛋白的酶活约为352U/mg rEGⅡ。该重组酶蛋白的最适反应温度为55℃,最适pH为4.0。本试验结果表明,家蚕BmNPV/Bac-to-Bac快速基因表达系统可作为生物反应器生产具有生物活性的重组纤维素酶(如rEGⅡ),为杂合内切葡聚糖酶基因在家蚕生物反应器中的表达打下了实践基础。2.杂合内切葡聚糖酶CelcdT’C’基因的分子设计及合成　　 瘤胃真菌P.rhizinflata羧甲基纤维素酶基因celA编码1个含有纤维素酶催化结构域Celcd的多肽。Celcd靠近N端是1个由28个氨基酸组成的连接肽,而C端则是一段仅由7个氨基酸组成的接合结构域,由这3部分组成的基因片段被命名为CelcdN’C’。除去CelcdN’C’靠近N端的连接肽(命名为CelcdC’),酶活没有发生很大改变,但其热稳定性急剧下降,证明N端连接肽具有稳定酶蛋白的作用。CelcdN’C’和CelcdC’对羧甲基纤维素的活性分别为344.9 U/mg和334.5 U/mg蛋白。研究证明,CelcdN’C’是带有一些外切葡聚糖酶活性但以内切葡聚糖酶活性为主的高活性瘤胃真菌纤维素酶,除去N端连接肽的那段区域CelcdC’为高酶活基因片段。　　 属于接合菌门的丝状真菌总状共头霉(S.racemosum BCC18080)能够分泌耐热内切葡聚糖酶,最适反应温度为70℃,相对而言要高于接合菌门其它霉菌的内切葡聚糖酶。经过NCBI-BLASTP比对,确定BCC18080内切葡聚糖酶的纤维素结合域和连接区的序列为耐热基因T’片段。　　 委托南京金思特生物公司合成CelcdTC’全基因,T’片段在N’端,CelcdC’在C’端,从而将CelcdC’以及T’基因片段成功拼接；同时考虑到后续实验,在N’端和C’端分别设计BamHI和HindⅢ酶切位点。CelcdT’C’全基因以EcoRV平端克隆方式克隆进pUC57-simple载体中,并冷冻保存待用。　　 3.杂合内切葡聚糖酶CelcdT’C’基因和亲本酶CelcalN’C’基因在大肠杆菌中的表达及纯化　　 采用亚克隆技术,以pET-30a(+)为表达载体,在E.coli BL21中表达了杂合内切葡聚糖酶CelcdT’C’基因和亲本酶CelcdN’C’基因,分别获得了阳性重组表达子BL21CelcdT’C’和BL21CelcdN’C’。在对基因工程菌用IPTG诱导表达4 h后,菌液破碎离心取上清,点样于羧甲基纤维素钠平板上,50℃培养6 h,经过刚果红染色,在平板上可见明显的透明圈,说明表达产物EcelcdT’C’以及ECelcdN’C’都具有羧甲基纤维素酶活性；进一步用SDS-PAGE进行分析检测,EcelcdT’C’与ECelcdN’C’分子量分别约为61 kDa和54 kDa,与推导的融合蛋白分子量一致。　　 根据葡萄糖标准曲线计算得出,过柱纯化后重组CelcdT’C’和CelcdN’C’内切葡聚糖酶活性分别为11.12U/ml和16.36 U/ml。它们的最适反应温度都为50℃,在动物生理温度范围内,亲本酶CelcdN’C’相对活性较高,在70℃以上高温,虽然杂合酶CelcdT’C’的酶活性要小于亲本酶CelcdN’C’,但是较亲本酶表现出更强的耐热性；它们的最适反应pH都为5.0,其中杂合酶蛋白在小肠的中性环境中能表现出较高活性,而CelcdN’C’酶蛋白在弱酸性环境中的酶活性相对较高。　　 4.杂合内切葡聚糖酶CelcdT’C,基因和亲本酶CelcdN’C’基因在家蚕蛹中的表达及大鼠饲喂效果研究　　 利用家蚕BmNPV/Bac-to-Bac快速基因表达系统成功构建了含有CelcdT’C’和CelcdN’C’基因的重组病毒,并先后感染家蚕BmN培养细胞及家蚕蛹。Westernblot分析鉴定结果表明,重组CelcdT’C’和CelcdN’C’酶蛋白在BmN细胞内成功表达,但上清中没有发现目的蛋白存在；在发病蚕蛹样品的上清粗酶液中,测得CelcdT’C’/CelcdN’C’的内切葡聚糖酶活性为463.4 U/mg CelcdT’C’和477.9 U/mgCelcdN’C’,最适反应温度分别为60℃和50℃。　　 为了测定所表达酶的效果,用大鼠评定了饲喂效果。试验分4个组:基础日粮(负对照组)、基础日粮添加2.0％普通蚕蛹粉(正对照组)、添加2.0％表达了瘤胃真菌内切葡聚糖酶基因的蚕蛹粉(亲本酶组)和添加2.0％表达了杂合内切葡聚糖酶基因的蚕蛹粉(杂合酶组),按单因子实验设计完成。将感染110 h的家蚕蛹粉碎成粉,按设计比例配制大鼠日粮,进行为期27 d的饲喂试验。结果发现,在大鼠基础日粮中添加2.0％的蚕蛹粉不会影响饲料的适口性,添加蚕蛹粉各组大鼠的饲料营养成分消化率(干物质消化率、粗蛋白消化率和粗纤维消化率)显著高于对照组(P＜0.05),杂合酶组消化率高于亲本酶组,体重增加有较高趋势。　　 综上所述,本研究设计的耐热、高活性的杂合内切葡聚糖酶CelcdT’C’基因能在BmNPV/Bac-to-Bac快速基因表达系统中有效生产,蛋白分子的空间结构得以维持,而且表达产物具有一定的热稳定性及较高的催化性能,经过高温制粒后,较其亲本酶CelcdN’C’具有较高的纤维素酶活性。