一、研究背景近年来,随着蚊媒染病的不断扩散,蚊媒防治已成为公共卫生领域的热点问题。化学防制是目前防蚊控蚊的主要策略。随着化学杀虫剂的频繁使用,蚊虫抗药性呈不断增强的趋势。目前,研究发现:在蚊虫抗性产生机制中代谢抗性与靶标抗性的作用机理与氨基酸水平的改变具有潜在相关性。本课题组前期工作发现:实验室抗性品系与敏感品系幼虫体内代谢物存在显著差异,多种氨基酸差异可能与抗性的产生相关。本研究利用液相色谱-串联质谱建立白纹伊蚊幼虫氨基酸代谢物的检测方法,探索白纹伊蚊幼虫体内与溴氰菊酯抗性形成及毒性相关的氨基酸标志物。二、研究目的1.建立白纹伊蚊氨基酸的液相色谱串联质谱联用检测方法;2.比较溴氰菊酯抗性品系与敏感品系白纹伊蚊幼虫氨基酸的水平差异,为白纹伊蚊溴氰菊酯抗性标志物筛选提供参考;3.观察溴氰菊酯暴露前后抗性白纹伊蚊幼虫氨基酸水平差异,探索溴氰菊酯毒性相关氨基酸标志物。三、研究方法1.液相色谱串联质谱联用检测方法的建立参考文献[1-2]建立液相色谱串联质谱联用(LC-MS/MS)检测方法,通过预实验进行参数校正。加入内标控制系统误差,设置6个平行样品控制随机误差,采用6种质控标准浓度氨基酸检测样本回收率。2.种群抗性测定采用WHO推荐的幼虫浸溃法检测白纹伊蚊种群的半数致死浓度(lethal concentration 50,LC50),根据待测样本与实验室敏感品系样本LC50的比值计算出抗性倍数确定抗性程度。3.野外蚊虫的采集与饲养根据文献报道[7]及课题组现场检测,分别从广州市城区和郊区采集不同抗性程度的白纹伊蚊幼虫,带回实验室饲养至F1代供实验用。4.抗性种群药物暴露实验参照WHO推荐的幼虫浸渍法,对确定为抗性种群的F1代白纹伊蚊幼虫进行溴氰菊酯暴露实验,分为药物暴露组、丙酮暴露组和空白对照组;暴露24h后回收各组幼虫样本,用于氨基酸检测。5.幼虫氨基酸水平的检测利用LC-MS/MS检测白纹伊蚊幼虫氨基酸信号,将信号峰导入Chemview软件进行定量分析,得到各组幼虫体内17种氨基酸浓度水平。6.统计分析与作图利用SPSS19.0进行统计分析,不同组别的氨基酸水平比较采用单因素方差分析,以p<0.05作为统计学差异的判断标准,作图采用R、Graphpad5.01软件。四、研究结果1.实验室抗性品系白纹伊蚊瓜氨酸与脯氨酸这2种氨基酸浓度水平明显高于实验室敏感品系(p<0.05);2.野生抗性品系与实验室敏感品系相比,有7种氨基酸水平出现差异(p<0.05),其中,抗性品系中的丙氨酸、瓜氨酸和脯氨酸高于敏感品系,谷氨酸、组氨酸和缬氨酸低于敏感品系;3.药物组幼虫体内12种氨基酸(丙氨酸、瓜氨酸、酪氨酸、甘氨酸、亮氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、组氨酸、苏氨酸、蛋氨酸)与空白对照组出现差异(p<0.05),其中11种氨基酸水平在暴露后降低,而组氨酸水平在暴露后升高;药物组与丙酮暴露组幼虫体内的丙氨酸、瓜氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸的变化出现统计学差异(p<0.05)。五、研究结论1.LC-MS/MS用于检测白纹伊蚊幼虫氨基酸水平检测,具有快速、简便、准确的特点;2.丙氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、组氨酸、脯氨酸、缬氨酸、蛋氨酸7种氨基酸可能与溴氰菊酯抗性相关;3.溴氰菊酯丙酮溶液暴露可导致抗性白纹伊蚊幼虫体内12种氨基酸水平发生改变,其中丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和瓜氨酸仅与溴氰菊酯暴露有关,其余7种氨基酸水平的改变与丙酮溶液相关。