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研究目的：白血病干细胞(LSCs)是白血病发生和耐药、复发的重要原因,其具有自我更新能力。目前的研究表明LSCs存在于CD34+/CD38-/CD123+细胞群中,但LSCs的精确表面标记尚不清楚。LSCs通过粘附分子与骨髓基质相互作用可能会促进白血病细胞的自我更新失调和凋亡受阻,这可能是LSCs能够逃逸化疗的机制之一。因此研究骨髓微环境(niche)相关的细胞表面标记,有助于靶向LSCs治疗靶点的发现。本实验中我们研究粘附分子N-cadherin,Tie2和CD44在白血病干细胞中的表达及化疗对上述抗原表达富集的影响,探讨其是否为LSCs的潜在标志。研究方法：用流式细胞术检测63例急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)患者骨髓单个核细胞(BMMNCs)化疗前后N-cadherin、Tie2、CD44、CD34、CD38和CD123的表达,观察LSCs (CD34+/CD38-/CD123+细胞群)中N-cadherin, Tie2和CD44的表达情况。联合免疫表型和荧光原位杂交技术,对4例伴有t(8；21)移位患者的BMMNCs,分选纯化CD34+/CD38-/CD123+/N-cadherin+和CD34+/CD38-/CD123+/Tie2+细胞群和CD34+/CD38-/CD 123+/N-cadherin-和CD34+/CD38-/CD 123+/Tie2-细胞群,检测AML1/ETO的表达情况。实时定量PCR技术,对5例AML患者的BMMNCs,分选纯化CD34+/CD38-/CD123+/N-cadherin+和CD34+/CD38-/CD123+/Tie2+细胞群和CD34+/CD38-/CD123+/N-cadherin-和CD34+/CD38-/CD123+/Tie2-细胞群,检测耐药基因MDR1mRNA的表达水平情况。结果：①在AML患者BMMNCs中N-cadherin和Tie2表达阳性的LSCs比例在停化疗当天与化疗前比较无明显差异,在停化疗后第7天分别由0.17%、0.02%升高到0.6%、0.94%(P<0.05,P<0.01),而CD44阳性细胞的LSCs比例由17.28%降低到2.25%(P<0.05)(中位数)；②在LSCs中,N-cadherin,Tie2和CD44表达阳性细胞比例在停化疗的第7天较化疗前分别升高了38.17(P=0.03)、210(P<0.01)、1.01(P=0.15)倍(中位数),提示N-cadherin+和Tie2+的LSCs细胞能抵抗化疗,可能是潜在的LSCs标志；③共表达N-cadherin和Tie2的LSC细胞群化疗后富集比例高于共表达CD44的LSCs细胞群,提示共表达CD44的LSCs细胞群可能比较成熟,而共表达N-cadherin和Tie2的LSCs细胞群可能是真正的LSC细胞群；④未缓解病例组中,共表达N-cadherin、Tie2和CD44的LSCs细胞群在治疗前和停化疗后第21天的比例明显高于缓解组病例,提示共表达N-cadherin、Tie2和CD44的LSCs细胞群可能是微量残留细胞,与预后不良有关；⑤细胞遗传学分组、CD56表达强弱分组及治疗前外周血白细胞计数分组显示共表达N-cadherin和Tie2的LSCs细胞群在预后不良组中的比例明显高于良好组,进一步提示N-cadherin+和Tie2+的LSCs与预后不良有关；⑥N-cadherin和Tie2在LSCs细胞群中的表达水平与临床骨髓涂片的幼稚细胞比例显著相关,提示检测共表达N-cadherin和Tie2的LSCs细胞群可作为临床评估预后及微量残留病的指标；⑦分选纯化的CD34+/CD38-/CD123+/N-cadherin+和CD34+/CD38-/CD123+/Tie2+细胞群,检测到AML1/ETO的融合信号分别是87.53%和92.18%,而分选纯化的CD34+/CD38-/CD123+/N-cadherin-和CD34+/CD38-/CD123+/Tie2-细胞群,检测到AML1/ETO的融合信号分别是72.36%和80.87%,提示AML1/ETO表达在干细胞水平,其恶性程度更高。⑧在分选纯化的CD34+/CD38-/CD123+/N-cadherin+细胞中检测到N-Cadherin mRNA的表达,而在CD34+/CD38-/CD123+/N-cadherin-细胞群中未检测到N-Cadherin mRNA的表达；在分选纯化的CD34+/CD38-/CD 123+/Tie2+和CD34+/CD38-/CD123+/Tie2-细胞群中,一位AML患者的标本检测到N-Cadherin mRNA表达,而另两位AML患者标本中未检测到N-Cadherin mRNA表达,提示部分患者LSCs中共表达N-Cadherin和Tie2；⑨分选纯化的CD34+/CD38-/CD123+/N-cadherin+和CD34+/CD38-/CD123+/Tie2+细胞群,检测到MDR1 mRNA,表达水平分别是8.16±1.07和4.18±3.93,而分选纯化的CD34+/CD38-/CD123+/N-cadherin-和CD34+/CD38-/CD123+/Tie2-细胞群,检测到MDR1mRNA,表达水平分别是0.06±0.06和0.46±0.49,进一步说明N-cadherin+和Tie2+的CD34+/CD38-/CD123+比N-cadherin-和Tie2-的CD34+/CD38-/CD123+对化疗更不敏感。结论：共表达粘附分子N-cadherin和Tie2的LSCs细胞群具有抵抗化疗的作用,能够通过化疗而富集,并表达AML1/ETO恶性分子和耐药基因MDR1,可以作为识别LSCs的潜在标志。研究目的：富含鸟嘌呤的寡核苷酸(G-rich oligonucletides, GRO)通过非反义途径,具有抑制肿瘤及白血病细胞生长和增殖的功能,诱导肿瘤细胞停滞于细胞周期的S期。GRO可以形成独特的G—四聚体的稳定折叠结构,可以与特异性核蛋白——核仁素结合。核仁素蛋白的表达水平反映细胞增殖状态,增殖旺盛的肿瘤细胞中核仁素蛋白表达水平高。有研究发现,细胞受到外来打击后,核仁素能与P53结合形成复合物。为研究GRO抗白血病细胞增殖的作用及机制,本实验探讨了GRO、核仁素和P53的相互作用,尤其是P53基因及其相关信号途径是否影响GRO的生物学作用。研究方法：设计GRO和其对照药物富含胞嘧啶的寡核苷酸(C-rich oligonucletides, CRO)。通过慢病毒载体将P53基因转入U937细胞系(缺失表达P53),分别用PBS、GRO及CRO处理U937细胞系、转染空载体和转染P53的U937细胞,从抑制增殖、促进细胞凋亡、诱导细胞周期停滞及对核仁素蛋白和周期蛋白的作用等方面检测P53基因对GRO药物作用的影响。研究结果：(1)GRO具有明显抑制细胞增殖,促进凋亡及诱导细胞周期停滞于S期的功能。(2)激光共聚焦结果显示：U937细胞中,GRO能与核仁素蛋白结合,可能是GRO发挥作用的机制。转染P53的U937细胞中, GRO的摄入减少。(3)转染P53后削弱GRO抑制细胞增殖、促进凋亡及诱导细胞周期停滞的作用。(4)GRO处理U937细胞24h后,CDK2蛋白表达水平增加,48h后CDK2蛋白表达水平降低,而GRO处理转染P53的U937细胞,细胞周期蛋白的表达出现滞后现象。研究结论：GRO可以抑制白血病细胞增殖、促进细胞凋亡及诱导细胞周期停滞于S期,而转染P53后,GRO摄入减少,其抑制增殖、促进细胞凋亡、诱导细胞周期停滞的生物学作用降低；GRO诱导细胞周期停滞的机制可能与CDK2有关,24h时CDK2表达增加,促进细胞进入S期,48h后CDK2表达降低使细胞停滞于S期。而P53的表达影响了细胞周期,细胞周期蛋白的表达出现滞后现象。本实验提示,P53与核仁素结合,影响了GRO的生物学作用,解释了GRO、P53、核仁素三者的相互关系,并对GRO的临床使用具有指导意义。