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一、研究背景胆管癌(Cholangiocarcinoma，CCA)是一种高致死率的消化道恶性实体肿瘤，侵袭转移是其致死的主要原因。手术切除能明显延长胆管癌病人的生存期，然而很多病人在就诊时即已发生微转移、淋巴结转移或远处转移，使手术无法达到根治的效果；而且很多完成手术的病人在术后2年内复发；这些均严重制约手术效果和病人预后。因此，研究胆管癌侵袭转移的分子机制，为临床胆管癌病人的治疗和预后分析提供适宜靶点十分必要。GATA6是进化保守的GATA转录因子家族的成员，其在胚胎发育过程中主要参与细胞增殖和分化的调控。GATA家族包括六个分子：GATA1/2/3主要表达于造血系统细胞，GATA4/5/6主要表达于中胚层和内胚层来源的组织，如心脏、消化道上皮、肝脏和肺等。近期研究报道GATA6在恶性实体瘤中表达发生明显改变，在肿瘤演进中发挥重要调控作用。而且，GATA6在不同组织来源的恶性肿瘤中表达变化情况和生物学作用明显不同。在脑星形细胞瘤、卵巢癌和肾上腺皮质肿瘤中GATA6表达明显降低，抑制肿瘤增殖，被认为是肿瘤抑制因子；相反，GATA6在胰腺癌、结肠癌和食管癌中的表达异常增高，促进细胞侵袭，是一个潜在的癌基因。有些学者将“GATA6这种在不同组织来源的恶性肿瘤中表达变化及作用明显不同”的模式解释为“组织来源特异性”。到目前为止，GATA6在胆管癌中表达模式目前未见报道。我们前期体外实验发现：胆管癌细胞QBC939中GATA6的mRNA表达显著高于原代胆管上皮细胞，提示：胆管癌中GATA6表达增加。然而这一结果需要进一步研究证实。而且，GATA6表达增加在胆管癌中的作用未知。文献报道GATA6能增强一些消化道上皮特异性基因的转录活性，从而调控其表达。67kDa层粘素受体(67kDa laminin receptor，67LR)是一种非整合素受体，表达于消化道上皮细胞表面，主要介导细胞与基底膜及细胞外基质的粘附。研究表达多种肿瘤中67LR表达增高，通过多种机制促进癌细胞侵袭转移。我们前期实验发现胆管癌中67LR过表达，显著促进癌细胞侵袭。恶性肿瘤中67LR过表达受转录和转录后水平的机制调控；在转录水平，研究报道一些转录因子能与67LR启动子结合，调控其转录活性。我们前期研究发现：QBC939细胞中67LR高表达亚群同时高表达GATA6；采用生物信息学预测发现：67LR基因启动子区存在GATA6的结合位点。因此，我们推测：GATA6可能与67LR启动子结合，调控67LR过表达。而GATA6可能通过调控67LR从而影响胆管癌细胞侵袭转移。二、研究假说综合既往研究报道和前期实验结果，我们提出以下研究假说：胆管癌中GATA6表达异常改变，与67LR启动子结合，上调67LR表达，从而促进癌细胞侵袭转移。本研究旨在阐明GATA6在胆管癌中的作用及相关机制，拓宽胆管癌侵袭转移的基础研究，为临床胆管癌靶向治疗提供实验依据。三、材料方法1.收集本科室2005-2010年间行肿瘤切除术的87例胆管癌病人的组织标本，采用免疫组化实验，对比癌组织和癌旁组织中GATA6表达差异；分析GATA6表达与病人临床病理特征的相关性；收集87例胆管癌病人的23例淋巴结转移灶和8例肝转移灶标本，对比转移灶与原发灶中GATA6的表达差异。2.收集87例胆管癌病人的随访资料(包括术后存活时间和无瘤存活时间)，采用Kaplan-Meier及Cox模型，分析GATA6表达与病人预后的关系。3.构建GATA6干扰和过表达载体，转染胆管癌细胞(QBC939和RBE)，干预GATA6表达；通过损伤修复实验、Transwell侵袭实验及裸鼠脾种植转移模型，研究干预GATA6对胆管癌细胞迁移、侵袭和转移能力的影响。4.采用免疫组化观察87例胆管癌组织中67LR的表达情况，分析67LR和GATA6表达的相关性。构建GATA6干扰和过表达载体，转染胆管癌细胞(QBC939和RBE)；通过real-time PCR、western-blot和流式检测实验，研究胆管癌细胞中干预GATA6表达对67LR表达的影响；采用染色质免疫共沉淀(ChIP)实验，研究胆管癌细胞中GATA6能否与67LR基因启动子结合。四、研究结果1.87例胆管癌组织中，39例癌组织(45%)呈现GATA6核染色阳性；而24例癌旁组织均GATA6核染色阴性；提示胆管癌中存在GATA6异常表达。分析GATA6表达与病人临床病理特性相关性提示：GATA6阳性表达与淋巴结转移显著相关，而与病人性别、年龄、组织分化程度、原发灶T分级和远处转移无关。32例淋巴结转移灶中，23例(72%)呈现GATA6核染色阳性，阳性率显著高于原发灶(45%)；8例肝转移灶中，5例(63%)呈GATA6核染色阳性，其阳性率也高于原发灶；这些结果提示：胆管癌中GATA6异常表达与肿瘤侵袭转移相关。2. Kaplan-Meier分析提示：GATA6阳性表达的病人术后总存活时间显著低于GATA6阴性组病人(log-rank p=0.002)；而其肿瘤复发显著早于GATA6阴性表达的病人(log-rank p=0.002)。Cox模型分析提示：GATA6异常表达是判断病人术后存活时间和复发的相对独立危险因素(HR=2.015,95%CI=1.188-3.418, p=0.01; HR=2.132,95%CI=1.271-3.576, p=0.004)。本部分结果提示：GATA6异常表达可能是判断胆管癌病人预后的潜在分子标志。3. QBC939细胞中GATA6的mRNA和核蛋白表达水平显著高于RBE细胞。QBC939细胞中，干扰GATA6表达显著抑制癌细胞的侵袭和迁移能力。RBE细胞中，过表达GATA6表达明显增强癌细胞的侵袭和迁移能力。动物实验发现：干扰GATA6表达显著抑制QBC939细胞的远处转移能力。本部分实验提示：GATA6明显促进胆管癌细胞侵袭转移。4.87例胆管癌组织中，35例(40%)呈现67LR膜染色阳性。卡方检验提示67LR表达与GATA6显著相关。连续切片免疫组化发现：67LR和GATA6表达与胆管癌组织的同一部位。QBC939细胞中，干扰GATA6表达导致67LR的蛋白和mRNA表达显著降低；RBE细胞中，过表达GATA6表达明显上调67LR的蛋白和mRNA表达。流式细胞检测发现：QBC939和RBE细胞中67LR的膜表达同样受67LR调控。ChIP实验结果提示：QBC939和RBE细胞中GATA6与67LR基因启动子区结合。本部分实验结果提示胆管癌细胞中GATA6与67LR基因启动子结合，调控其表达。五、研究结论胆管癌中存在GATA6异常表达，其异常表达提示病人预后不良；而且GATA6可能通过上调67LR表达促进胆管癌细胞侵袭转移。