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第一部分Nek2基因沉默对卵巢癌SKOV3细胞生物学行为的影响目的设计合成有效的Nek2-siRNA,转染入卵巢癌SKOV3细胞,观察NEK2表达的变化及其对SKOV3细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭以及细胞周期的影响。方法1.采用免疫组织化学法检测Nek2在上皮性卵巢癌组织中的表达情况。2.采用化学合成法,设计三条针对Nek2基因的siRNA,转染入卵巢癌SKOV3细胞48小时后,分别采用Real-time RT-PCR技术及Westernblotting技术检测Nek2基因和蛋白表达水平的变化,筛选出一条干扰效果最好的Nek2-siRNA以进行后续实验。3.将Nek2-siRNA转染入卵巢癌SKOV3细胞后,采用MTT法检测SKOV3细胞增殖能力的变化;采用流式细胞技术检测SKOV3细胞凋亡和细胞周期的变化;采用Transwell小室检测SKOV3细胞迁移及侵袭能力的变化。结果1.在上皮性卵巢癌组织中Nek2的表达水平明显增高。2. Nek2-siRNA转染SKOV3细胞48小时后,与对照组相比,Nek2的mRNA水平和蛋白表达水平均显著降低(P<0.05),其中干扰组2(NEK2-siRNA序列2)下降最为明显。空白对照组与阴性对照组相比,无统计学差异(P>0.05)。3.通过对转染后48小时及72小时的各组细胞进行MTT法检测发现:Nek2-siRNA干扰组细胞增殖能力显著低于空白对照组细胞和阴性对照组细胞,抑制率分别为32.1%,43.8%,(P<0.05)。4. Nek2-siRNA转染48小时后,流式细胞技术检测凋亡结果显示,空白对照组、阴性对照组和RNA干扰组的SKOV3细胞凋亡率分别为:(5.00±0.09)%、(5.53±0.24)%和(10.98±0.16)%,(P<0.05)。流式细胞技术检测细胞周期的结果显示,空白对照组、阴性对照组和RNA干扰组处于G2/M期的细胞比例分别为:13.72%、12.27%和1.56%,与对照组相比较,处于G2/M期的干扰组细胞明显减少(P<0.05)。5. Nek2-siRNA转染48小时后,迁移实验结果显示:空白对照组、阴性对照组和干扰组的穿膜细胞数分别为(351.3±14.2)、(360.7±11.1)、(95.7±6.2),干扰组与对照组相比迁移细胞数明显下降(P<0.05)。侵袭实验结果显示:空白对照组、阴性对照组和干扰组的穿膜细胞数分别为(340±17.3)、(329.3±13.6)、(27.3±5.1),干扰组与对照组相比侵袭细胞数明显下降(P<0.05)。结论1. Nek2在上皮性卵巢癌组织以及细胞中高表达,且RNAi干扰技术能有效的抑制其表达。2. Nek2-siRNA转染能使卵巢癌SKOV3细胞增殖减弱、凋亡增加以及迁移侵袭能力下降,细胞进入G2/M期受阻,导致细胞最后不能顺利通过有丝分裂期,进入下一个细胞周期。3. Nek2可作为抑制卵巢癌转移和复发的重要靶点。第二部分NEK2基因沉默对卵巢癌SKOV3细胞生物学行为影响的分子机制的初步研究目的初步研究Nek2-siRNA转染对卵巢癌SKOV3细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及其细胞周期影响的相关分子机制。方法1. Western blotting技术检测Nek2-siRNA转染入卵巢癌SKOV3细胞48小时后,与凋亡相关的因子Caspase-3、Bad及Bcl-2蛋白表达水平的变化。2. Western blotting技术检测Nek2-siRNA转染入卵巢癌SKOV3细胞48小时后,与侵袭转移相关的因子MMP-2、MMP-9及TIMP-1蛋白表达水平的变化。3. Western blotting技术检测Nek2-siRNA转染入卵巢癌SKOV3细胞48小时后,与细胞周期相关的因子cyclinB1、CDK1及P27蛋白表达水平的变化。4. Western blotting技术检测Nek2-siRNA转染入卵巢癌SKOV3细胞48小时后,ERK1/2磷酸化水平的变化。结果1. Western blotting技术检测结果表明:NEK2基因沉默后,与对照组相比,SKOV3细胞内Caspase-3和促凋亡因子Bad的蛋白表达增加,而抗凋亡因子Bcl-2的蛋白表达降低(P<0.05)。2. Western blotting技术检测结果表明:NEK2基因沉默后,与对照组相比,SKOV3细胞内MMP-2、MMP-9的表达明显下降,而TIMP-1的表达显著上调(P<0.05)。3. Western blotting技术检测结果表明:NEK2基因沉默后,与对照组相比,SKOV3细胞内cyclinB1和CDK1的蛋白表达水平较对照组明显下降,P27的蛋白表达水平明显上调(P<0.05)。4. Western blotting技术检测结果表明:NEK2基因沉默后,与对照组相比,SKOV3细胞内ERK1/2磷酸化水平明显下降(P<0.05)。结论1.抑制Nek2基因的表达可上调caspase-3及Bad的蛋白表达水平,下调Bcl-2的蛋白表达水平,从而抑制卵巢癌SKOV3细胞促进细胞凋亡。2.抑制Nek2基因的表达可上调TIMP-1的蛋白表达水平,使MMP-2及MMP-9的蛋白表达水平下降,从而抑制了卵巢癌SKOV3细胞的迁移和侵袭。3.抑制Nek2基因的表达可上调P27的蛋白表达水平,下调cyclinB1及CDK1的蛋白表达水平,从而阻止SKOV3细胞进入G2/M期,不能启动有丝分裂,无法进入下一个细胞周期,抑制了卵巢癌SKOV3细胞增殖。4. Nek2通过ERK信号转导通路调控卵巢癌SKOV3细胞的生物学行为。