论文部分内容阅读
Fas属于TNFR超家族蛋白。它由位于胞外的富含半胱氨酸重复结构域和位于细胞内死亡结构域组成。在阐明Fas介导的凋亡通路过程中,人们发现了一些能与Fas死亡结构域发生协同作用的蛋白,FADD便是其中的一种。为了更系统全面的揭示FADD的生物学功能,我们用FADD对人源的心脏cDNA文库进行了酵母双杂交的筛选。经过5轮筛选,我们找到了一些在酵母细胞中能与FADD发生相互作用的蛋白。这其中就有Metallothionein 2A即MT2a,通过免疫共沉淀(CO—IP)我们验证了这种相互作用。为了确定MT2a与FADD相互作用的结构域,我们以GST融合表达的形式将FADD的各个结构域构建到pALEX质粒中及MT2a的各个结构域构建到带有Flag标签的pRK5质粒中。通过GST—Pull down实验,我们确定了FADD通过其C末端与MT2a的β亚基发生相互作用。
为了更好的进一步研究这种相互作用的细胞学意义,MT2a抗体的制备成为了不可缺少的步骤之一。MTs是一类富含半胱氨酸、无酶活性的胞内低分子量蛋白(6-7 kDa)。不够幸运的是,我们在大肠杆菌所表达的哺乳动物MT2a融合蛋白主要以包涵体的形式存在。这种包涵体形式的MT2a约占转化大肠杆菌表达总蛋白的20%。我们利用12%的SDS—PAGE对33KDa的GST—MT2a进行分离,经考马丝亮蓝显色后将其从胶上割下研碎后注射兔子以生产MT2a抗血清。
为了解决MT2a纯化过程中的降解问题,我们在pTΩRG质粒(pET32a的一种变体)的基础上构建出一种新的质粒载体:pT7MT(GenBank accession No.DQ504436),它含有T7启动子,在MCS的下游处含有MT2a的基因序列,目的基因构建进载体后便可以与MT2A融合表达。MT2A的金属结合属性使得融合蛋白的纯化可以通过镍柱等金属螯合肽亲和层析实现。我们应用这个载体已经成功实现对MT—GST和MT—Troponin Ⅰ的融合表达,这两种蛋白通过一步Ni2+亲和层析即可以很容易在细胞裂解上清中获得。MT—GST和MT—Troponin Ⅰ的最终产量分别达到了30mg/1和28mg/1。这表明pT7MT有可能成为一种高产稳定的融合蛋白表达载体。
最后我们对FADD和MT2A参与的信号通路进行了研究。众所周知,磷酸化在信号通路蛋白活性调节中扮演着重要的角色。但FADD的磷酸化与否对于其参与Fas介导的凋亡通路是没有影响的。我们的研究则发现与非磷酸化FADD刚好相反,磷酸化FADD能与MT2a发生相互作用并对一些信号通路产生影响。FADD已被报道参与了细胞周期和细胞增殖的调控,但具体机制现在还不清楚。我们的研究则揭示了磷酸化FADD通过MT2A参与了NF—κB的激活。MT2A在其中扮演了“调节子”的角色。核定位数据显示,当FADD和MT2A共同过量表达时,他们大量定位于细胞核中。而单独过量表达时,这两种蛋白则都聚集在细胞质里。
最近以来,由TCR/CD3引发的T细胞激活和凋亡的信号通路正得到逐步阐明。但T细胞自身对凋亡和激活增殖的选择则一直迷雾重重。我们利用MouseGenome 4302.0基因芯片对鼠源T细胞增殖刺激0小时和18小时基因表达的差异进行了比较分析。结果表明刺激18小时后,T细胞的基因表达谱与0小时相比有巨大变化。这其中FADD、MT2A、NF—κB的表达量都有上调,进一步的RT—PCR及WESTERN实验也证明了MT2A在T细胞激活过程中的表达量上调。这或许能为我们揭示静息T细胞对于增殖和死亡的选择提供了一条线索。