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目的探讨EntransterTM-CD25siRNA纳米粒抑制大鼠高危角膜移植术后免疫排斥反应及延长角膜植片存活时间的作用。本实验分为两部分：实验一：探讨非病毒载体EntransterTM-CD25siRNA、脂质体-CD25siRNA对正常SD大鼠角膜转染率和转染毒性,筛选最佳转染试剂实验二：通过纳米载体介导CD25siRNA来干预高危角膜移植术后的大鼠角膜,探讨CD25siRNA在角膜移植排斥中的作用方法实验一：制备EntransterTM-CD25siRNA复合物(EntransterTM组)、脂质体-CD25siRNA复合物(脂质体组)、CD25siRNA (siRNA组)和生理盐水(对照组)。将80只正常成年SD大鼠随机法分为四组,均选右眼为实验眼,在裂隙灯下刮除SD大鼠角膜上皮,分别将上述四种转染试剂按照相同剂量点眼于所有模型大鼠眼表,于点眼后12h,24h,3d,7d在裂隙灯下观察大鼠眼球情况,行荧光显微镜检测四种转染试剂的转染率,行HE染色、TUNEL染色检测转染试剂对角膜的毒性,行CD11b抗体检测角膜对转染试剂的免疫应答。实验二：以96只SD大鼠为受体,48只Wistar大鼠为供体。受体右眼碱烧伤后14天行穿透性角膜移植手术。术后将大鼠随机分为4组：A组为阴性对照组；B组为EntransterTM-control CD25siRNA治疗组；C组为EntransterTM-CD25siRNA治疗组；D组为二次治疗组,除了术后给予EntransterTM-CD25siRNA点眼外,术后第7天再次点眼。自术后第1d起每日在裂隙灯下观察大鼠角膜情况并对其排斥情况进行评分。行HE染色检测角膜组织病理情况、透射电镜观察植片超微结构、免疫组化和荧光定量PCR法检测角膜CD25的表达。结果实验一：由荧光显微镜检测结果显示,对照组实验模型无阳性结果,EntransterTM组荧光表达数量及强度高于脂质体组,siRNA组荧光表达早但至24h已完全衰减。HE染色、TUNEL染色、CDllb抗体检测结果显示脂质体转染试剂引起的角膜炎性反应、角膜细胞凋亡和免疫应答明显强于其余三组。实验二：C、D两组角膜植片存活时间相比A、B两组明显延长,差异具有统计学意义(p<0.05)。HE显示A、B组角膜植片增厚、水肿,胶原纤维排列紊乱,大量炎性细胞浸润；C、D组植片排斥程度较A、B组明显减轻。免疫组化显示CD25分子在各组角膜上皮层、基质层、内皮层均有表达,A、B组中的表达明显多于C、D组。透射电镜结果显示实验组角膜植片基质层成纤维细胞凋亡与坏死较对照组减轻,超微结构改变具有明显差异。A、B两组角膜植片中CD25 mRNA的表达明显高于C、D两组,差异具有统计学意义。结论1.选用非病毒纳米EntransterTM作为载体,转染CD25siRNA于正常SD大鼠角膜,具有转染效率高、低毒性、不引起角膜免疫反应的特点,为角膜疾病基因治疗选择合适的载体提供了基础。2. CD25siRNA纳米粒可减轻角膜移植术后免疫排斥反应,有效延长角膜植片存活时间。