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研究背景和目的:腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm,AAA)是腹主动脉永久性、不可逆性的局部扩张,可引起主动脉破裂这一致命性后果。目前针对腹主动脉瘤唯一可行的治疗是手术预防因较大的瘤体(>5.5cm)破裂所造成的患者死亡。然而,目前有高达90%的腹主动脉瘤患者的动脉瘤直径低于手术标准(<5.5cm),针对这部分人群并无明确证实可有效限制该疾病进展的药物,而造成这种困境最大的原因在于对腹主动脉瘤发病机制的认识十分有限。既往已公认的是,腹主动脉瘤本质上是一种促炎性反应,腹主动脉瘤的发生发展由广泛性的血管炎性反应所驱动和维持,是涉及所有血管细胞类型在内的复杂过程,伴随着广泛分布于血管且显著上调的促炎细胞因子(如白细胞介素-6,interleukin-6,IL-6)以及趋化因子等的表达。因此,理论上干扰腹主动脉瘤血管壁的炎性反应具有强大的治疗潜能。然而,涉及腹主动脉瘤炎症的诸多具体通路及其调控机制至今远未充分阐明,这极大阻碍了人类对腹主动脉瘤的认识及掌控。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一种细胞内重要的调控因子,在多种刺激条件下可通过多种分子机制如编码基因转录调节、表观遗传修饰、转录后修饰等对基因表达、细胞分化进行强大的调控。LncRNA H19是一种高度保守的印迹基因簇,在胎儿中高表达,成年后仅在骨骼肌、心肌中表达。在不同组织的多种细胞类型发生紊乱时,H19可重新表达。近年实验提示,H19的重新表达与炎症性疾病有密切联系。如在胆管癌细胞中,氧化应激可诱导H19重新表达,促进炎性IL-6的上调,从而促进癌细胞的迁移和入侵;H19过表达可激活炎症途径而加速动脉粥样硬化;抑制H19可缓解由氧化修饰的低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的脂肪生成和炎症反应;在与腹主动脉瘤发生具有较强相关性的高同型半胱氨酸血症的小鼠模型中,H19重新大量表达于主动脉平滑肌层。以上这些证据提示,H19有可能通过调控血管炎症来影响腹主动脉瘤的形成与发展。因此,本实验旨在探究lncRNAH19是否可通过增强炎症反应促进腹主动脉瘤的形成与发展。首先,我们在两种经典的小鼠腹主动脉模型的腹主动脉标本中检测H19的表达量变化。其次,通过病毒转染技术,我们对主动脉中H19含量进行过表达和敲低,观察其对腹主动脉瘤发生发展的作用。此外,我们还探讨了 H19通过促进血管炎症影响腹主动脉瘤形成发展的分子机制。方法:1.实验动物:取健康的成年雄性C57BJ/6C小鼠及雄性ApoE-/-小鼠。2.用Ang Ⅱ诱导腹主动脉瘤模型:实验组ApoE-/-小鼠经微型泵泵入血管紧张素-2(angiontensin-Ⅱ,AngⅡ,1.44mg/kg/d),对照组 ApoE-/-小鼠泵入等量生理盐水,持续泵入28天可得到腹主动脉瘤模型。3.用氯化钙诱导腹主动脉瘤模型:行剖腹手术分离腹主动脉,将浸透0.5 mol/1氯化钠的纱布敷盖于C57BL/6J小鼠腹主动脉外膜表面15分钟。对照组用生理盐水(0.9%)代替。3周后可得腹主动脉瘤模型。4.腹主动脉瘤的定性:处死小鼠后对腹主动脉进行固定。观察是否发生腹主动脉瘤,测量腹主动脉最大直径,按照严重程度将腹主动脉瘤分为Ⅰ-Ⅳ类。5.弹性蛋白染色与降解测定:对弹性纤维蛋白进行van Gieson染色,按弹性纤维降解程度的轻重评分为1-4分。6.免疫组织化学分析:在相应条件下,用一抗、二抗孵育标本,并对腹主动脉壁中 H19、IL-6、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)、巨噬细胞抗原-2(macrophage antigen-2,MAC-2)进行染色及定量。7.免疫印迹分析:检测H19、MCP-1、MAC-2、IL-6在腹主动脉中的蛋白表达水平。8.LncRNA原位杂交:检测小鼠标本中的H19分布及含量。9.聚合链式反应:检测H19、MCP-1、MAC-2、IL-6在腹主动脉壁中的RNA表达水平。10.腺病毒载体介导的H19敲低与过表达:用腺病毒作为载体实现小鼠全身(含腹主动脉)H19表达量的过表达及敲低。11.荧光素酶实验:体外构建突变型IL-63’UTR、突变型H193’UTR,并与野生型IL-6 3’UTR、野生型H19 3’UTR分别转染至含let-7a有功能或无功能类似物的平滑肌中。检测细胞内荧光素酶的活性,反映RNA间的结合水平,从而推测胞内let-7a与IL-6、let-7a与H19的是否具有结合位点。12.体外功能实验:在细胞溶液中加入let-7a的拮抗剂及类似物,检测不同分组的IL-6荧光蛋白水平。13.统计学分析:使用SPSS 16.0软件对数据进行统计学的分析。所有数据用均数±标准差(Mean±SD)或百分比表示,P<0.05认为差异有统计学意义。用Student-t检验比较配对数据;组间差异采用单因素方差分析。结果1.H19表达量在Ang Ⅱ以及氯化钙诱导的小鼠腹主动脉瘤模型中上调:PCR、Western Blot、原位杂交技术证明,在两种成功造模的腹主动脉瘤中,H19的RNA含量显著增高,H19在腹主动脉壁中主要表达于中层平滑肌。2.检测病毒介导的H19在腹主动脉壁敲低及过表达的效率:从腺病毒介导过表达或敲低H19的第30天起,腹主动脉壁出现显著且稳定的敲低及过表达效果,且持续稳定至第60天。3.敲低腹主动脉H19可减少Ang Ⅱ诱导的腹主动脉瘤形成及其相应的炎性反应:敲低H19可使Ang Ⅱ诱导的腹主动脉瘤发生率显著降低,使腹主动脉壁IL-6、MCP-1、MAC-2炎性介质的RNA和蛋白质表达水平降低。4.腹主动脉过表达H19含量可促进Ang Ⅱ及氯化钙诱导的腹主动脉瘤形成及相应炎性反应:过表达H19可使Ang Ⅱ及氯化钙诱导的腹主动脉瘤发生率显著增高,同时使腹主动脉壁IL-6、MCP-1、MAC-2炎性介质的RNA和蛋白质表达水平增高。5.H19通过内源性竞争miRNA let-7a从而增高IL-6的含量:荧光素酶实验结果显示,细胞内具有let-7a与H19、let-7a与IL-6的有效结合位点;体外功能实验证明,let-7a是H19介导上调IL-6的下游关键分子。H19通过内源竞争RNA机制结合miRNA let-7a,阻止let-7a对IL-6基因转录的抑制从而增高IL-6的含量。结论腹主动脉血管平滑肌中的lncRNAH19可通过促进主动脉壁炎症而介导腹主动脉瘤形成。H19的这种促腹主动脉瘤发生的作用与其通过ceRNA机制抑制microRNA let-7a活性、从而诱导腹主动脉白介素-6上调相关。