产单核细胞李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)是一种重要的人兽共患食源性病原菌,可引起以脑膜炎、脑炎、败血症为特征的李斯特菌病。国内外的研究表明猪肉是各类食品中Lm污染最严重的食品。脉冲场凝胶电泳(pulse-field gel electrophoresis,PFGE)是近年发展起来的细菌分型的方法,由于其具有重复性好、分辨率高、敏感性强等特点,成为细菌亚分型的“金标准”,在国外该方法已多次成功识别特异性致病菌,追溯食源性疾病爆发的来源,并确定不同地区/时间爆发的食源性疾病之间的关联性,然而,这方面的研究在国内开展较少。本文的研究目的是:(1)针对生猪屠宰加工流通各环节进行Lm的流行病学监测,了解目前生猪屠宰加工流通中Lm污染率的现状;对江苏地区部分健康羊群和羊圈环境Lm的污染率进行初步的调查研究;(2)建立Lm的PFGE分型方法;(3)应用建立的PFGE方法对不同来源的Lm菌株进行分型,完成菌株的相似性距阵分析,绘制系统发生树。1.产单核细胞李斯特菌的污染状况调查根据生猪屠宰加工厂生产流程和HACCP系统原理,选择待宰猪环境、宰前、屠宰过程(肠道)、生鲜猪肉入库前、冷库肉、市场销售生鲜猪肉等六个关键环节采集680份样品进行Lm的监测,检测方法选用本实验室建立的基于hly基因的PCR扩增方法。结果显示生产流程从宰前到猪肉入库均未检测出Lm,而在待宰猪圈环境、冷库肉和市场肉样品中检测到Lm的存在,污染率分别为1%、3%和6.9%,这就提示加强对猪圈环境、冷库环境定期消毒处理的重要性,市场环节的高污染率提示在猪肉进入流通领域后应尽可能减少各种外部因素造成的污染或污染加重。采集扬州大学联环药业基因工程有限公司生产基地健康羊群的鼻腔拭和肛拭111份样品,江苏海门种羊场健康4月龄小公羊、怀孕母羊、哺乳母羊、哺乳期小羊鼻腔拭样本和环境样本311份,共422份样品进行Lm的污染状况调查。结果显示环境样品的阳性率最高,达到12.8%,6株Lm中有4株分离自隔离区环境,2株分离自羊圈环境;其次为哺乳母羊鼻腔拭样品,分离到1株Lm,阳性率为2.1%;怀孕母羊、哺乳小羊、小公羊鼻腔拭样品的阳性率均为0。此结果提示应该按操作规程对隔离区环境和其它羊圈环境进行严格管理,此外提高干草料的质量,减少羊群密度,加强羊只运动也是保证羊群健康的有效措施。2.产单核细胞李斯特菌脉冲场凝胶电泳分型方法的建立确定PFGE方法的主要步骤为:细菌包埋琼脂块、包埋固定的细菌释放染色体、包埋块清洗处理、酶切、脉冲场凝胶电泳和获得图谱后进行软件分析。通过以下几方面对PFGE方法进行优化:细菌的包埋浓度、酶切前包埋块的处理、包埋块的清洗过程、酶切时间和酶量、PFGE电泳参数(转换时间、电泳时间、温度等)和图谱的分析方法。通过对参考菌株进行PFGE方法的探索,获得了条带亮度和清晰度都较为理想的脉冲图谱,最终确定了Lm脉冲场分型的一系列最佳条件。(1)细菌的最佳包埋浓度为OD610=1.3(1.25-1.35之间);(2)细菌在包埋进琼脂糖之前先用溶菌酶于37℃孵育处理10分钟,选用普通低熔点琼脂糖代替Seakem Gold Agarose(SKG)来包埋细菌,溶菌酶处理后的菌液与低熔点琼脂糖等体积比混匀制取包埋块;(3)包埋块的清洗过程:先用50℃预热的超纯水、TE各清洗两次,每次45分钟,再加入含PMSF的TE液处理30分钟,最后再用超纯水和TE液清洗包埋块各两次;(4)酶切过程:选用AscI寡切点酶对细菌染色体进行原位酶切,酶切前增加冰水浴预处理半小时的步骤,酶用量为2μL/slice(40U/μL),酶切时间3小时以上;(5) PFGE电泳参数:场强:6.0V/cm,电场夹角:120°,温度:12℃,电场转换时间为4.0s-40.0s,电泳时间为22h;(6)使用Quantity One软件对结果进行分析,绘制菌株的系统发生树,完成菌株的相似性距阵分析。本文建立的针对Lm的PFGE方法除了具备脉冲分型固有的重复性好、分辨率高、敏感性强等特点外,针对其存在的耗时、成本高的局限也有较大的改善,缩短了从菌株培养到数据获得的时间,降低了实验成本,并且对于其它革兰氏阳性菌PFGE分型方法的探索也具有重要的参考价值,为Lm的溯源追踪提供了很好的技术平台。3.产单核细胞李斯特菌的耐药性及PFGE分子亚分型分析选用15种常用的抗生素,以大肠杆菌ATCC25922为质控菌株,对从食品、环境、临床分离到的50株Lm进行抗菌药物敏感实验,试验方法和结果判读按美国NCCLs手册《抗微生物药物敏感试验执行标准》进行。结果显示在50株Lm中,有3个菌株对所有药物敏感,47个菌株产生了11种耐药谱。同时对50株不同来源的Lm菌株进行PFGE分型分析,所得结果以Quantity One软件绘制菌株的系统发生树,并完成菌株的相似性距阵分析。结果表明,50株Lm中相似程度最高的为分离自同一市场RTE食品的两株Lm,相似性系数达到94.0%。分离自同一市场同类食品以及同一市场新鲜食品和环境污水的Lm菌株间也显示了较高的相似性。临床脑膜炎病人的Lm分离株与分离自市场RTE食品的Lm菌株相似性系数高达86.8%。本研究还比较了抗生素耐药谱和PFGE限制性内切酶谱,以及PFGE谱和RAPD谱的流行病学价值,结果表明PFGE具有分辨力高,重复性好的特点,是研究产单核细胞李斯特菌分子流行病学理想的基因分型方法。