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糖基化修饰是蛋白质翻译后修饰中主要的修饰方式之一。研究表明,细胞50%以上的蛋白质存在糖基化修饰。蛋白质糖基化在蛋白质的折叠、蛋白质胞内转运、受体活化、分子识别、信号传导、细胞内吞作用、分子稳态、细胞排斥、细胞黏附等众多生物过程中起着重要的调节作用。蛋白质糖基化分为N-糖基化、O-糖基化和GPI锚定糖基化。其中O-糖基化发生在蛋白质丝氨酸或苏氨酸残基的羟基氧原子上。O-连接氮乙酰半乳糖胺修饰(O-GalNAc)和O-连接氮乙酰葡糖胺修饰(O-GlcNAc)是两种重要的O-糖基化。O-GalNAc修饰糖基化反应由多肽GalNAc转移酶(ppGalNAc-Ts)催化起始,在其他特异性糖基转移酶催化下继续延伸,生成含有分枝O-连接复杂聚糖结构。O-GlcNAc糖基化则是在O-GlcNAc糖基转移酶(OGT)催化下,利用UDP-GlcNAc为底物糖供体,将GlcNAc共价连接到蛋白质的丝/苏氨酸残基上的一种动态可逆单糖修饰。这两种O-糖基化修饰底物分布广泛,功能各异,参与调节了几乎所有重要生理过程和重大疾病的发生发展。本课题组前期研究表明,重要的人源转录因子叉头盒蛋白A1(FOXA1)可能发生以上两种O-糖基化修饰,并影响FOXA1的生理功能,但糖基化位点未知。本研究旨在通过建立体外O-GalNAc、O-GlcNAc糖基化反应体系,利用蛋白质谱分析鉴定体外FOXA1的O-GalNAc及O-GlcNAc糖基化位点。首先在293T细胞中表达分泌型的ppGalNAc-T2酶,亲和纯化获得具有酶活性的ppGalNAc-T2酶蛋白;在大肠杆菌系统表达、纯化获得的重组人源FOXA1蛋白。在体外,将重组人源FOXA1蛋白、ppGalNAc-T2酶蛋白与UDP-GlcNAc共孵育后,利用特异性识别O-GalNAc糖基的凝集素VVL进行凝集素印迹分析,结果发现FOXA1可在体外发生O-GalNAc糖基化。进一步,ESI-ETD-MS/MS质谱分析结果显示,S355为FOXA1蛋白在体外ppGalNAc-T2酶的O-GalNAc修饰位点。其次,在293T细胞真核表达系统中转染pCMVPuro-FOXA1-HA质粒,获得HA标签融合表达的FOXA1重组蛋白。利用HA抗体免疫沉淀及抗O-GlcNAc抗体进行免疫印迹分析的结果表明,FOXA1在真核细胞内可发生O-GlcNAc糖基化修饰。当人源OGT和带有组氨酸(His)标签的人源FOXA1在大肠杆菌BL21(DE3)中共表达后,利用His标签,亲和纯化得到了发生O-GlcNAc修饰的人源FOXA1重组蛋白;利用ESI-ETD-MS/MS质谱分析该蛋白的O-GlcNAc修饰位点,结果表明:S298、S301、T432、S441和S443为FOXA1蛋白的O-GlcNAc修饰位点。以上结果表明,S355为FOXA1蛋白在体外ppGalNAc-T2酶催化的O-GalNAc修饰位点;S298、S301、T432、S441和S443可能是FOXA1蛋白在细胞内的O-GlcNAc修饰位点。这些糖基化位点的鉴定为进一步研究FOXA1蛋白O-糖基化修饰功能提供了实验基础,具有理论意义。