【摘 要】
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目的:筛选比较梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)各外膜蛋白的抗原性和同源性,分别构建真核表达重组体pcDNA3.1(+)-Gpd、pcDNA3.1(+)-Tp92和双基因融合表达重组体pcDNA3.1(+
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目的:筛选比较梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)各外膜蛋白的抗原性和同源性,分别构建真核表达重组体pcDNA3.1(+)-Gpd、pcDNA3.1(+)-Tp92和双基因融合表达重组体pcDNA3.1(+)-Gpd-Tp92,检测其所诱导产生的体液免疫和细胞免疫应答水平,比较单基因核酸疫苗和双基因融合核酸疫苗的免疫效果,为研制高效、新型的Tp核酸疫苗提供实验依据。 方法:用PCGENE软件分析Tp外膜蛋白Gpd和Tp92基因序列,设计相应特异性引物,PCR分别扩增上述两基因1059bp和2103bp的目的基因片段,将其插入pUCm-T载体,通过蓝白斑初筛,酶切分析、PCR及测序鉴定筛选阳性重组体;将Gpd和Tp92基因亚克隆至真核表达载体构建pcDNA3.1(+)-Gpd、pcDNA3.1(+)-Tp92和pcDNA3.1(+)-Gpd-Tp92重组体,并分别转染HeLa细胞,用免疫细胞化学及western blot鉴定其在真核细胞的表达;分别在0、2、4、8w将核酸疫苗pcDNA3.1(+)-Gpd、pcDNA3.1(+)-Tp92、pcDNA3.1(+)-Gpd-Tp92及对照空质粒pcDNA3.1(+)分组注射于新西兰兔后腿股四头肌,每次剂量为100/μg,末次免疫后2w,无菌分离兔脾细胞,经特异性重组蛋白抗原刺激后,ELISA双抗体夹心法测定培养上清中IFN-γ水平,ELISA间接法测定新西兰兔血清中抗Gpd和抗Tp92特异性抗体水平;MTT法、淋巴细胞转化试验测定脾淋巴细胞特异性增殖反应。 结果: 成功构建了pcDNA3.1(+)-Gpd和pcDNA3.1(+)-Tp92单基因真核表达载体
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