论文部分内容阅读
目的:骨髓间充质干细胞(BMSCs)在疾病治疗中具有一定疗效,但移植体内的BMSCs的存活率和活力有限,对病人生活质量的提高不太理想,而移植的干细胞的凋亡可能是影响干细胞存活率低的重要原因之一,因此本课题通过培养大鼠BMSCs,编码Rspo1的腺病毒转染BMSCs,研究Rspo1是否具有抑制BMSCs凋亡的功能,并进一步探索其抑制凋亡的机制是否与Wnt/β-catenin信号通路有关。方法:1.全骨髓贴壁法提取并培养BMSCs;2.成骨、成脂分化诱导鉴定BMSCs分化潜能;3.流式检测BMSCs表面标志物CD29、CD90、CD45;4.编码Rspo1腺病毒转染BMSCs,BMSCs分为三组:BMSCs组、BMSCs-GFP组和BMSCs-Rspo1组;5.qPCR和Western-blot分别检测Rspo1基因和Rspo1蛋白在三组细胞中的表达水平;6.分别用流式和AO-EB双染检测BMSCs凋亡率;7.Western-blot检测凋亡相关蛋白Bax、Caspase3和Cleavage-Caspase3的表达水平;8.qPCR和Western blot检测Wnt/β-catenin信号通路中关键因子β-catenin、JNK和phospho-JNK在三组细胞中的表达水平;9.加入Wnt/β-catenin信号通路的阻断剂LGK974后,检测凋亡相关蛋白Bax、Caspase3和Cleavage-Caspase3和Wnt/β-catenin信号通路中关键因子β-catenin、JNK和phospho-JNK在三组细胞中的表达水平。结果:1.培养的BMSCs经成骨成脂诱导分化后,可见红褐色类圆形钙结节和橘红色圆形脂滴形成;2.流式检测BMSCs表面标志物CD29表达率为(97.1±0.76%),CD90表达率为(95.83±0.76%),CD45表达率为(3.93±0.6%);3.qPCR和Western blot结果显示:BMSCs-Rspo1组Rspo1基因和Rspo1蛋白表达均明显高于BMSCs组和BMSCs-GFP组(p﹤0.01);4.流式检测凋亡结果显示:BMSCs-Rspo1组的凋亡率(25.02±3.58)%明显低于BMSCs组(43.63±2.16)%和BMSCs-GFP组(44.56±2.04)%(p﹤0.01);5.AO-EB双染检测凋亡结果显示:BMSCs-Rspo1组中绿色和橘红色并呈固缩状或圆珠状的早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞明显少于BMSCs组和BMSCs-GFP组;6.Western blot结果显示:BMSCs-Rspo1组Bax,Caspase3和Cleavage-Caspase3蛋白表达均明显低于BMSCs组和BMSCs-GFP组(p﹤0.01);7.BMSCs-Rspo1组中CTNNB1和JNK基因和β-catenin、JNK和phospho-JNK蛋白表达水平均明显高于BMSCs组和BMSCs-GFP组(p﹤0.01);8.加入Wnt/β-catenin信号通路的阻断剂LGK974后,Western blot结果显示:BMSCs-Rspo1+LGK974组CTNNB1和JNK基因和β-catenin、JNK和phospho-JNK蛋白表达水平明显低于BMSCs-Rspo1组(p﹤0.01),Bax、Caspase3和Cleavage-Caspase3蛋白表达均明显高于BMSCs-Rspo1组(p﹤0.01),BMSCs-Rspo1+LGK974组与BMSCs组无明显差异。结论:1.全骨髓贴壁分离法培养得到状态良好的BMSCs。2.Rspo1在腺病毒转染的BMSCs中成功高表达。3.高表达Rspo1可抑制BMSCs的凋亡。4.Rspo1抑制BMSCs的凋亡可能与Wnt/β-catenin信号通路有关。