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SRY(sex-determining region of the Y chromosome,鼠上称Sry)是Y染色体上的性别决定基因,是激发哺乳动物两性潜能的性腺向雄性分化的开关基因。雄性性别分化的过程是以SRY基因为主导的一系列上游基因和下游基因参与的级联反应过程。由于SRY基因的体内研究难于操作致使SRY基因的调控网络研究进展缓慢,至今为止, SRY的下游作用靶基因还没有鉴定出来。为进一步研究SRY基因功能,本研究采用siRNA表达载体介导的RNAi技术,特异性地抑制睾丸决定因子Sry在小鼠胚胎中的表达。观察Sry基因沉默后对在两性性腺分化中起重要作用的WT1 (Wilms’tumor gene)、Sox9 (Sry-related HMG box-9)、SF1 (Steroidogenic fator-1)、GATA4 (GATA binding protein 4)、AMH (Anti Mullerian Hormone)和DAX1 (Dosage sensitive sex reversal locus-1)基因表达的影响,以及对小鼠胚胎性腺组织发育的影响。进一步揭示了Sry基因的调控机制,并为研究附植后小鼠胚胎发育基因提供了新思路。主要研究内容和结论如下:1) Sry小干扰RNA表达载体的重构,及其在胚胎中的表达鉴定。在本课题组先前构建的siRNA重组表达载体(pSilencer4.1/Sry565)和对照载体(pSilencer 4.1-CMV neo)上分别插入EGFP表达框,即重构为含有绿色荧光蛋白的Sry干扰载体pSilencer4.1/Sry565-EGFP(简称为pSry565-EGFP)和对照载体pSilencer 4.1-CMV EGFP vector(简称为pControl-EGFP)。应用尾静脉注射法将siRNA表达载体和对照载体分别导入妊娠9.5天(9.5dpc)的母鼠体内,在11.5dpc时取胚胎,在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白在小鼠胚胎中全身表达。证明,应用尾静脉大量注射法可以将干扰质粒通过孕鼠导入小鼠胚胎,且干扰质粒在胚胎中广泛表达无明显组织特异性。2)siRNA表达载体对Sry基因抑制效果检测。在11.5dpc时取胚胎,对胚胎进行性别鉴定。性别鉴定为雄性的胚胎以RT-PCR法检测Sry mRNA的表达抑制效果,用Western-blot检测SRY蛋白表达抑制效果。结果表明,pSry565-EGFP的抑制效果显著,Sry基因的mRNA和蛋白表达水平均降低,对Sry mRNA和SRY蛋白的抑制率可达80%。3)Sry基因抑制对WT1,SF1,DAX1,GATA4,Sox9及AMH基因表达的影响。用RT-PCR法检测WT1等上述性别决定相关基因表达变化情况。结果表明,Sry基因沉默后,WT1基因表达量升高;而被认为最有可能是Sry下游基因的Sox9基因的表达没有明显变化;GATA4,SF1,DAX1基因表达水平也没有显著变化;在Sry基因表达抑制的小鼠胚胎和阴性对照的胚胎中均未检测到AMH基因表达。结论,Sry基因表达抑制会导致WT1基因表达升高;另外,Sry基因激活Sox9基因的表达可能需要其他的辅助因子协同作用。4)Sry基因沉默对小鼠胚胎性腺发育的影响。取12.5dpc,13.5dpc,15.5dpc的雄性小鼠胚胎性腺进行组织切片观察小鼠性腺发育。观察F1代小鼠5周龄、3月龄时睾丸发育情况。结果表明,小鼠胚胎性腺发育受阻,出生后小鼠睾丸发育不良。证实了Sry基因沉默显著影响小鼠胚胎的性腺发育和睾丸发育。