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目的:枳葛口服液是全国名老中医孙同郊教授依据其多年临床工作经验自拟出的解酒经验方,为了更加深入地探究该方解酒保肝功效的作用机制,本实验构建了酒精性肝损伤大鼠模型,从嘌呤受体P2X7/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(P2X7R/NLRP3)信号通路着手探讨枳葛口服液改善大鼠酒精性肝损伤炎症反应的具体机制。
方法:60只SPF级雄性SD大鼠经适应性喂养1周后随机等分为以下5个组(n=12):正常组、酒精性肝损伤模型组(简称为模型组)、枳葛口服液高剂量组(简称高剂量组)、枳葛口服液中剂量组(简称中剂量组)、枳葛口服液低剂量组(简称低剂量组)。正常组予以蒸馏水每天10 mL/kg灌胃,其余4组均予以52% Vol泸州老窖二曲白酒灌胃,灌入容量为10 mL/kg,枳葛口服液高、中、低剂量组在白酒灌胃后间隔6小时再分别予以枳葛口服液按照每天10、5、2.5 mL/kg的给药容量灌胃。持续干预12周后麻醉大鼠取腹主动脉血,然后处死大鼠取出肝脏,生化法检测血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、γ-谷氨酰基转移酶(GGT)的表达水平;苏木精&伊红(HE)染色分析大鼠肝病理学变化;蛋白印迹法(Western blot)分析P2X7R/NLRP3通路相关蛋白变化情况;免疫组织化学法分析NLRP3在肝脏中表达情况;酶联免疫吸附实验(Elisa)用于检测不同组别大鼠血清中白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-18(IL-18)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、核因子-κB(NF-κB)含有量。
结果:1.各组大鼠肝损伤血清标志物比较:与正常组相比,模型组ALT、AST、GGT等明显升高(P<0.01);与模型组相比较,各个给药组上述指标均有不同程度的下降,且呈现量-效关系改变。2.各组大鼠肝脏HE染色比较:与正常组相比,模型组大鼠肝脏HE染色可见肝组织结构排列紊乱,边界模糊,肝细胞内可见大小不一的脂滴形成,并且伴有炎症细胞浸润以及部分肝细胞坏死;与模型组相比较,各给药组肝组织病理损伤均有不同程度的恢复。其中,以高剂量组恢复最明显,已基本接近正常组,中剂量组次之,而低剂量组与模型组相差不明显,同样可见大小不一的脂肪空泡。3.P2X7R/NLRP3信号通路关键蛋白相对表达量比较:与正常组相比,模型组P2X7R、NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白含量显著增强,差异具有统计学意义(P<0.01);与模型组相比,枳葛口服液各个给药组P2X7R、NLRP3、Caspase-1、ASC等蛋白表达水平均有不同程度的下降,其中高剂量组上述指标下降最显著(P<0.05或P<0.01)。使用免疫组化法对肝内NLRP3蛋白进行染色,其结果同样显示,较正常组相比,模型组NLRP3明显升高(P<0.01),而经枳葛口服液干预后则有不同程度的恢复。4.不同组别大鼠血清炎症损伤相关因子水平比较:与正常组相比,模型组及低剂量组血清IL-6、IL-18、TNF-α、NF-κB含量明显升高(P<0.01);与模型组比较,枳葛口服液高剂量及中剂量组以上指标均有不同程度的下降,其中高剂量组下降最明显(P<0.01),低剂量组与模型组相比未见明显差异(P>0.05)。
结论:1.慢性酒精灌胃可成功构建大鼠酒精性肝损伤模型;2.枳葛口服液具有明显改善大鼠酒精性肝损伤所致炎症反应的作用,其机制可能通过调控P2X7R/NLRP3信号通路相关蛋白的表达,减轻大鼠炎症损伤相关因子的产生,从而起到改善酒精性肝损伤的作用。
方法:60只SPF级雄性SD大鼠经适应性喂养1周后随机等分为以下5个组(n=12):正常组、酒精性肝损伤模型组(简称为模型组)、枳葛口服液高剂量组(简称高剂量组)、枳葛口服液中剂量组(简称中剂量组)、枳葛口服液低剂量组(简称低剂量组)。正常组予以蒸馏水每天10 mL/kg灌胃,其余4组均予以52% Vol泸州老窖二曲白酒灌胃,灌入容量为10 mL/kg,枳葛口服液高、中、低剂量组在白酒灌胃后间隔6小时再分别予以枳葛口服液按照每天10、5、2.5 mL/kg的给药容量灌胃。持续干预12周后麻醉大鼠取腹主动脉血,然后处死大鼠取出肝脏,生化法检测血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、γ-谷氨酰基转移酶(GGT)的表达水平;苏木精&伊红(HE)染色分析大鼠肝病理学变化;蛋白印迹法(Western blot)分析P2X7R/NLRP3通路相关蛋白变化情况;免疫组织化学法分析NLRP3在肝脏中表达情况;酶联免疫吸附实验(Elisa)用于检测不同组别大鼠血清中白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-18(IL-18)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、核因子-κB(NF-κB)含有量。
结果:1.各组大鼠肝损伤血清标志物比较:与正常组相比,模型组ALT、AST、GGT等明显升高(P<0.01);与模型组相比较,各个给药组上述指标均有不同程度的下降,且呈现量-效关系改变。2.各组大鼠肝脏HE染色比较:与正常组相比,模型组大鼠肝脏HE染色可见肝组织结构排列紊乱,边界模糊,肝细胞内可见大小不一的脂滴形成,并且伴有炎症细胞浸润以及部分肝细胞坏死;与模型组相比较,各给药组肝组织病理损伤均有不同程度的恢复。其中,以高剂量组恢复最明显,已基本接近正常组,中剂量组次之,而低剂量组与模型组相差不明显,同样可见大小不一的脂肪空泡。3.P2X7R/NLRP3信号通路关键蛋白相对表达量比较:与正常组相比,模型组P2X7R、NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白含量显著增强,差异具有统计学意义(P<0.01);与模型组相比,枳葛口服液各个给药组P2X7R、NLRP3、Caspase-1、ASC等蛋白表达水平均有不同程度的下降,其中高剂量组上述指标下降最显著(P<0.05或P<0.01)。使用免疫组化法对肝内NLRP3蛋白进行染色,其结果同样显示,较正常组相比,模型组NLRP3明显升高(P<0.01),而经枳葛口服液干预后则有不同程度的恢复。4.不同组别大鼠血清炎症损伤相关因子水平比较:与正常组相比,模型组及低剂量组血清IL-6、IL-18、TNF-α、NF-κB含量明显升高(P<0.01);与模型组比较,枳葛口服液高剂量及中剂量组以上指标均有不同程度的下降,其中高剂量组下降最明显(P<0.01),低剂量组与模型组相比未见明显差异(P>0.05)。
结论:1.慢性酒精灌胃可成功构建大鼠酒精性肝损伤模型;2.枳葛口服液具有明显改善大鼠酒精性肝损伤所致炎症反应的作用,其机制可能通过调控P2X7R/NLRP3信号通路相关蛋白的表达,减轻大鼠炎症损伤相关因子的产生,从而起到改善酒精性肝损伤的作用。