论文部分内容阅读
左乙拉西坦(Levetiracetam)是比利时UCB公司开发的第二代乙酰胆碱激动剂,主要用于治疗局限性及继发性全身性癫痫。于2000年4月获得美国FDA批准并在美国上市,于2006年首次获准在中国市场进行销售、使用,购药数额每年涨幅达到60%-70%,是目前报道的唯一具有预防癫痫发生的抗癫痫药物。由于其特效、低副作用的药性,在全球范围内应用越来越广泛。在工业领域,其合成工艺也日益受到重视。2009年我国医院市场中14个抗癫痫药物品种的销售量分析数据显示,左乙拉西坦位列第5。据预测,到2016年为止,美国抗癫痫药物市场将持续保持在30亿美元左右的销售额。左乙拉西坦以其良好的药理、药代活性作用,将是医药领域中的强势竞争品种之一。腈水解酶(Nitrilase,EC 3.5.5.1)是一类重要的腈转化酶,经一步反应直接将腈化合物水解生成相应的羧酸和氨。腈类化合物的酶法水解具有高效性和高选择性,同时其反应条件温和、环境污染小,因此符合原子经济和绿色化学发展的方向。2-氨基丁腈经区域和立体选择性水解合成(S)-2-氨基丁酸,是诸多左乙拉西坦化学-酶法合成工艺中原子经济性最优的路线,其难点在于获得对2-氨基丁腈具有高活性和高选择性的腈水解酶。本研究通过对实验室38株腈水解酶筛选,得到一株能立体选择性催化外消旋2-氨基丁腈制备(S)-2-氨基丁酸菌株E.coli BL21(DE3)/pET28b-Nitbll6402,该重组菌在100 mM底物,pH 7.2和35℃下转化12 h,底物转化率和产物e.e.值分别达到11.3%和100%。根据Phyre服务器预测E.coli BL21(DE3)/pET28b-Nitbll6402腈水解酶三维结构,提交至HOTSPOT服务器预测该酶“热点”氨基酸位点,分析和选择了12个位于活性中心附近的氨基酸残基(198Y,239P,272P,252P,102F,194R,196K,195D,251K,240E,192L,234M)作为突变靶位点。以质粒pET28b-Nitbll6402为模板,设计饱和突变引物,利用全质粒扩增技术,构建突变文库。随后利用薄层层析高通量初筛,液相色谱进一步复筛,得到水解活力明显提高的正突变体192L-62,195D-72,240E-91和251K-85。其中195D-72的活力提高至原始菌的3.12倍,该突变菌在100 mM底物,pH7.2和35℃下转化12h,底物转化率和产物e.e.值分别达到35.3%和100%。通过单因素实验考察了各种反应条件(温度、p H、底物浓度、菌体量)对192L-62催化拆分的影响。结果表明,其最佳反应条件为:pH8.0 Tris-HCl(100 mM),250 mM 2-氨基丁腈,0.2 g/L湿菌体,35℃。在优化条件下,192L-62能够高选择性、高效率地水解2-氨基丁腈生成(S)-2-氨基丁酸,反应12 h后,底物转化率和产物e.e.值分别达到87.2%和100%。