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对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)与干扰素-γ(IFN-γ)协同作用的研究已经有将近三十年的历史了,临床医疗研究发现TNF-α对肿瘤的生长具有明显的抑制作用,适用于多种晚期肿瘤尤其是已经失去手术机会,或对放疗、化疗不敏感的肿瘤治疗。但由于TNF-α是具有多种生物活性功能的蛋白质,因缺少靶向性与较为严重的毒副作用,制约了TNF-α的临床应用。IFN-γ与TNF-α的联合用药能提高肿瘤细胞膜表面与TNF-α结合的受体数量,同时也能调节细胞的免疫作用诱导肿瘤细胞发生凋亡,在一定程度上减低了TNF-α的毒副作用。但由于IFN-γ自身也存在一定的毒副作用,通过静脉注射TNF-α/IFN-γ时患者常因不能耐受其副作用而中止用药。因此对TNF-α/IFN-γ的改性与用药方式的改善显得尤为必要。 本论文研究通过对TNF-α/IFN-γ蛋白进行改性,使其连接上具有光活性的叠氮基团,通过紫外光的照射共固定到生物医用高分子材料表面,制备成共固定TNF-α/IFN-γ修饰的生物材料。共固定的TNF-α/IFN-γ通过化学键的交联能紧紧地固定于高分子材料的表面,从而避免了静脉注射时局部TNF-α/IFN-γ浓度过高而引起的副作用。由于高分子材料体积很大,肿瘤细胞无法通过胞吞胞吐的方式躲避药物的杀害。从而使药物能持久地与肿瘤细胞膜表面的受体相结合,持续地向细胞内发送死亡诱导信号。 论文研究中通过紫外吸收光谱,高效液相色谱测量,原子力显微镜、共聚焦荧光显微镜观察等手段检测TNF-α/IFN-γ修饰的生物材料制备情况;通过苏木素染色观察生物材料诱导宫颈癌HeLa细胞的死亡形态与普通游离态TNF-α/IFN-γ诱导HeLa细胞死亡形态的差别;通过流式细胞仪与免疫印迹实验检测生物材料诱导HeLa细胞膜表面受体表达的情况;通过免疫荧光实验对关键的信号转导蛋白进行亚细胞定位;并用慢病干扰与基因芯片表达的实验方法筛选生物材料诱导HeLa细胞死亡信号路径中可能发挥关键调控作用的信号调控因子;同时对固态的光化学修饰方法进行优化,在液态环境下将TNF-α/IFN-γ共固定到油酸包裹的Fe3O4纳米粒子上,从而提高纳米粒子的载药效率,使其能在荷宫颈癌肿瘤的裸鼠模型中研究共固定TNF-α/IFN-γ抗肿瘤的生物学机制。 通过大量的实验数据,我们发现TNF-α/IFN-γ能成功地接上光活性基团,并且能较为均匀地固定于生物医用高分子材料表面,很好地改善了单固定药物时易交联成团的形态,使共固定的TNF-α/IFN-γ能更为充分地和肿瘤细胞膜上的受体相结合。制备好的生物材料对HeLa细胞的生长有明显的抑制作用,在24孔细胞培养板中,20ng/ml的剂量就能明显地诱导HeLa细胞死亡。与游离态药物诱导细胞染色质凝聚,成球状或半月状的凋亡形态不同,生物材料诱导细胞染色质凝集的程度较低,呈凋亡样程序性细胞死亡的形态。对与TNF-α/IFN-γ相结合的细胞膜TNFR1、IFN-γR1蛋白表达量的检测发现细胞膜上的TNFR1对生物材料的应答并不明显,但胞内的肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域蛋白TRADD(TNF receptor-associated death domain)、 Fas受体相关死亡结构域蛋白FADD(Fas-associating protein witha novel death domain)等接头蛋白的表达却呈上调趋势,表明生物材料表面共固定的TNF-α/IFN-γ可能在光化学修饰的过程中改变了TNF-α/IFN-γ的空间构象,使其与TNFR1相类似的受体结合从而激发了胞内接头蛋白的表达。在干扰素信号路径中,IFN-γR1蛋白对生物材料的应答也不明显,主要是通过IFN-γR2蛋白介导的干扰素信号路径诱导HeLa细胞死亡,但原本在干扰素信号通路中起关键信号调控作用的信号转导转录激活子1(STAT1)的表达并不明显。用基因芯片筛选干扰IFN-γR2蛋白前后STATs家族基因表达的变化,发现信号转导转录激活子6(STAT6)可能替代STAT1在干扰素信号路径中发挥关键的诱导HeLa细胞死亡的信号传导调控作用。在将TNF-α/IFN-γ共固定到油酸包裹的Fe3O4纳米粒上后,与共固定到聚苯乙烯材料上时发挥类似的生物学功能,对荷宫颈癌裸鼠肿瘤的生长具有明显的抑制作用,裸鼠肿瘤组织中STAT6的表达与磷酸化与体外实验结果相吻合。 综合本研究结果:论文的研究很好地完成了对TNF-α/IFN-γ化学修饰改性,将药性改良与材料表面修饰相结合,优化了TNF-α与IFN-γ抗肿瘤效力的同时降低了药物的毒副作用。并对该生物材料诱导宫颈癌细胞HeLa干扰素路径信号转导机制进行了深入的研究,补充完善了干扰素路径信号转导的调控机制,为开发新型的高分子药物提供理论依据与研究模型。