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由革兰氏阴性黄单胞杆菌水稻致病变种Xanthomonas oryzae pv.oryzicola(Xoc)引起的水稻细菌性条斑病(简称水稻条斑病)是目前水稻生产上最主要的细菌性病害之一。与水稻白叶枯菌不同,水稻条斑菌在叶肉细胞间隙繁殖并致病,在水稻遗传种质中也尚未鉴定主效抗性基因,推测与病原菌中可能存在某些特异效应因子可抑制寄主的抗性反应相关。 本课题前期常清乐(2013)通过白叶枯菌PXO99a和本生烟的互作激发过敏反应系统在PXO99a中筛选条斑病菌RS105的基因组文库,发现携带有条斑病特异效应分子avrRxo1基因片段的克隆能抑制PXO99a在烟草上的HR反应。并通过相关实验证明了决定avrRxo1抑制子功能与无毒基因功能受不同结构域决定。同时,以avrRxo1为诱饵蛋白,通过酵母双杂交技术从粳稻中花11 cDNA文库中筛选到多个水稻互作蛋白。 为研究avrRxo1在水稻条斑菌中致病性功能,本研究对其中的一个AvrRxo1互作蛋白的编码基因OsPSK4(编码PP-PSK,psk-α前体蛋白)进行了转基因功能研究。分别构建了OsPSK4基因的超量表达载体pCXUN-HA∷OsPSK4和抑制表达载体ds1301∷OsPSK4并通过农杆菌介导的遗传转化方法转化水稻品种中花11。结果发现超量表达OsPSK4基因能够显著降低水稻对细菌性条斑病菌RS105的抗性水平,与野生型中花11对照植株相比,转基因阳性株系接种RS105后的病斑长度要增长0.8-2.45cm。定量RT-PCR检测表达水平显示,OsPSK4表达量在超量表达阳性植株中显著升高,且RS105细菌数量相比野生型中花11植株也显著增高,与增强感病的表型相一致;与之相反,抑制表达OsPSK4基因能够显著提高水稻对细菌性条斑病菌RS105的抗性水平,与野生型中花11对照植株相比转基因阳性株系的病斑长度要缩短1.14-1.21cm,与荧光定量检测靶标基因的表达结果相符。从而说明AvrRxo1互作蛋白OsPSK4在水稻对细菌性条斑病的抗性中起着负调控作用。 为进一步验证PSK介导的信号传导在水稻对细菌性条斑病的抗性中起着负调控作用,本实验通过基因检索的方式从水稻中获得疑似修饰OsPSK4基因成熟的同源基因OsTPST(编码磺基转移酶,修饰PP-PSK),并针对此基因构建了抑制表达载体ds1301∷OsTPST并成功进行了遗传转化。结果发现转基因阳性植株中OsTPST表达量显著受到抑制,而水稻对细菌性条斑病菌RS105的抗性水平则相应有所提高。与野生型中花11对照植株相比较,转基因阳性株系接种RS105后的病斑长度缩短0.89-1.18cm不等。表明OsTPST也在水稻对细菌性条斑病的抗性中起着负调控作用。根据拟南芥中同源基因介导的功能分析,OsTPST可能通过参与调控OsPSK4成熟,从而参与水稻对抗细菌性条斑病的调控。 综上所述,本实验鉴定了OsPSK4和Os TPST在水稻与条斑病菌互作过程中发挥负调控植物免疫的功能。初步解释了AvrRxo1与OsPSK4蛋白的互作的生物学意义,暗示其可通过正向调控PSK途径参与致病性功能。