论文部分内容阅读
研究目的缺血性卒中反复发作导致患者死亡率增加和残疾程度加重,而在第一次短暂性脑缺血发作或小卒中发作后给予神经保护剂可为反复卒中发作的治疗提供机会。白藜芦醇(resveratrol, RSV)对缺血性卒中是有效的神经保护剂,但其作用机制尚不清楚。RSV与沉默信息调节因子2相关酶1(silent information regulator T1,SIRT1)和腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)代谢应激元件有关,且参与细胞内能量代谢反应。本研究先制作两次发作大脑中动脉缺血大鼠模型(Middle Cerebral Artery Occlusion, MCAO),再通过氧-葡萄糖剥夺(oxygen-glucose deprivation,OGD)原代皮层神经元培养模型,建立体外反复缺血模型,观察RSV预处理大鼠体内、外脑缺血模型对SIRT1蛋白表达、AMPK表达和ATP含量的影响,研究白藜芦醇对大鼠体内、外反复缺血模型的神经保护作用,探讨其作用机制,从而为治疗反复发作缺血性卒中开发新的脑保护剂治疗提供帮助。方法成年18-20月龄雄性Wistar大鼠38只,采用微型动脉瘤夹夹闭法制作首次MCAO(n=14)和再次MCAO模型(n=16),随机分为RSV治疗组(25mg/kg/day)和实验对照组,术后3天测定各组大鼠脑梗死体积并评价行为缺损的变化。另外8只大鼠为假手术组,随机分为RSV治疗组(25mg/kg/day)(n=5)和对照组(n=3),用于测定血浆、肝脏和脑组织RSV浓度。原代皮层神经元取自18天Wistar雌性大鼠胚胎,培养成功后通过两次OGD法制作体外反复缺氧模型,实验组OGD处理前3小时采用50uM白藜芦醇干预,对照组采用DMSO培养液处理。采用Western免疫印迹技术测定体内、外脑缺血大鼠模型的SIRT1表达、AMPK表达,SIRT1活性和ATP水平采用试剂盒测定；采用SIRT1和AMPK特异抑制剂证实RSV对OGD神经元的神经保护作用。结果1.与对照组比较,RSV显著降低首次MCAO大鼠脑梗死体积和改善神经行为损害(P<0.01,P<0.01),尤其是显著降低再次MCAO大鼠脑梗死体积和改善神经行为损害(P<0.001,P<0.01)；RSV显著降低首次和再次OGD诱导的体外培养皮层神经元死亡率(P<0.001)。2.与对照组比较,RSV显著升高缺血脑组织和OGD处理培养皮层神经元的SIRT1活性(P=0.0014和P=0.002)；但3天RSV治疗未显著增加缺血大鼠脑组织的SIRT1表达水平(P>0.05)。而3小时RSV预处理能够增加OGD处理培养皮层神经元SIRT1表达水平(P<0.05)。3.与对照组比较,RSV均能显著升高缺血脑组织和OGD处理培养神经元的AMPK活性(P<0.01)。4.与对照组比较,白藜芦醇喂养3天后假手术组、首次MCAO组和再次MCAO组大鼠缺血脑组织ATP含量显著增高(P<0.001),白藜芦醇使组织内ATP含量升高1.5-2倍；白藜芦醇干预培养皮层神经元3小时后正常对照组、首次OGD组和再次OGD组皮层神经元内ATP含量显著增高(P<0.001)。5SIRT1抑制剂Sirtno1和AMPK抑制剂Dorsomorphin均可消除RSV对OGD体外反复缺血模型的神经元的保护作用。结论RSV对首次和二次复发体内、外的大鼠脑缺血模型均具有神经保护作用,RSV的神经保护作用与调节SIRT1蛋白活性、增强AMPK表达和降低脑缺血时能量需求有关。