论文部分内容阅读
结核病(Tuberculosis，TB)仍然是仅次于艾滋病(acquired immune deficiencysyndrome，AIDS)，在全球范围内由单一传染病病原体引起的危害人类健康的最大杀手。我国是22个结核病高负担国家之一，仅次于印度。同时，我国耐多药结核(MDR-TB)日益增多，且结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtuberculosis）与人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)共同感染的人数持续增加，加重了结核病危害和防治工作的难度。目前，尚无有效、快速地诊断结核病的方法，同时，已经有研究证实BCG的保护效果不理想，尚无有效的预防结核病的疫苗。结核分枝杆菌蛋白抗原的研究在开发新型结核病诊断方法和研究新型结核病疫苗中都存在着重要的作用。 传统的观点是，结核病是由单一的结核分枝杆菌感染引起的，且这种感染对外源性的再感染具有免疫保护作用。近年来，随着对结核病分子流行病学研究技术的发展、结核病感染传播机制研究的深入，人们对结核分枝杆菌的多重感染有了更深刻的认识。结核分枝杆菌的多重感染是指在结核病人体内先后或者同时感染2种或2种以上的不同基因型的结核分枝杆菌。 首先，通过文献查阅、免疫表位数据库(Immune epitopedatabase and analysis resource，IEDB)查询等方法，筛选出九种结核分枝杆菌蛋白抗原，分另为MPT64、TB10.4、HSP70、HSP65、PPE68、CFP10、EspJ、EspK和Mas，进行了克隆表达和纯化。同时，本研究随机选取37株结核分枝杆菌临床分离株，5μm孔径滤膜过滤法制备单个细菌菌悬液，改良罗氏培养基（L(o)wenstein-Jensen slants,L-J培养基）接种37℃培养，选取生长良好的单个菌落进行培养增菌，提取基因组DNA。采用Spoligotyping(Spacer oligonucleotidetyping)和15位点的MIRU-VNTR(Mycobacterial interspersed repetitiveunits-variable number tandem repeat)进行基因分型鉴定，比较临床分离株与其相应的单克隆分离株的分型结果。 本研究成功构建出这九种结核分枝杆菌重组蛋白，并经测序验证，BLAST比对相符率均为100％。构建的重组蛋白利用镍柱进行纯化，获得了这九种结核分枝杆菌蛋白抗原的重组蛋白，经过蛋白定量检测，MPT64、TB10.4、HSP70、HSP65、PPE68、CFP10、EspJ、EspK、Mas-1和Mas-2重组蛋白的浓度(μg/mL)分别为405.125、755.125、92.625、130.125、80.125、617.625、105.125、267.625、92.625和380.125。这为今后利用这些蛋白进行抗原的诊断效能研究和新型疫苗研究提供了基础。 本研究共获得37株临床分离株和相应的292个单克隆分离株。其中，有8株临床分离株分离的单克隆标本数均不足5个，不适合用于多重感染的研究，故剔除。即29株临床分离株分离的270个单克隆标本用于本研究，Spoligotyping和MIRU-VNTR分型结果显示27株结核分枝杆菌临床分离株与相应的单克隆分离株的分型结果一致，2株临床分离株的单克隆分离株呈现了多种基因型，多重感染率为6.9％。研究结果显示Spoligotyping和MIRU-VNTR可用于快速、有效地区分结核分枝杆菌的多重感染。同时，可结合使用具有更高分辨力的VNTR位点，用于结核分枝杆菌多重感染的研究，提高检出率。