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原花青素(proanthocyanidins, PC)是广泛存在于水果、蔬菜、坚果、花和籽皮特别是葡萄籽中的一类多酚化合物,属于生物类黄酮,目前国内外大量研究表明,来自葡萄籽中的原花青素具有多种生理及药理活性,包括抗菌,抗病毒,抗炎,抗肿瘤,抗氧化,抗过敏以及心脏保护作用等,但是原花青素对INS-1细胞的影响尚未见报道。本实验通过体外细胞培养,观察原花青素对链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)所致大鼠胰岛素瘤细胞(INS-1细胞)损伤的保护和修复作用,为天然抗氧化物质预防和治疗糖尿病提供实验依据。将对数生长期的INS-1细胞用0.25%的胰蛋白酶消化制成1×105细胞/mL单细胞悬液,接种于细胞培养板,培养24小时后,随机进行分组,每组6个复孔：(1)正常对照组(2)STZ (3mmol/L)组：加入终浓度为3mmol/L的STZ溶液(3)PC组：加入不同浓度的PC溶液,使其终浓度分别为6.25μg/ml、2.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml(4)PC保护组：加入终浓度为3mmol/L的STZ溶液,同时加入不同浓度的PC溶液,使其终浓度分别为6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml(5)PC修复组：加入终浓度为3mmol/L的STZ溶液,培养6小时后加入不同浓度的PC溶液,使其终浓度分别为6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml(6)阿托品组：细胞中加入终浓度为1×10-6mol/L的阿托品(7)阿托品+原花青素组：细胞中加入终浓度为1×10-6mol/L的阿托品,同时加入不同浓度的PC溶液,使其终浓度分别为6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml(8)异搏定组：细胞中加入终浓度为1×10-7mol/L的异搏定(9)异搏定+原花青素组：细胞中加入终浓度为1×10-7mol/L异搏定,同时加入不同浓度的PC溶液,使其终浓度分别为6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml采用上述分组后,用噻唑蓝(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT)法测定细胞增殖活性,放免法检测细胞上清液胰岛素含量,比色法检测细胞上清液丙二醛(malonaldehyde, MDA)的含量和总抗氧化能力(total antioxidant capacities, T-AOC),倒置显微镜下观察细胞形态,流式细胞术检测原花青素对INS-1细胞周期的影响。所有数据均采用SPSS16.0软件进行统计学分析,各项指标均以均数士标准差(x±s)表示,各组之间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),卡方检验(χ2-test)以P<0.05为差异有统计学意义。实验结果如下：1.葡萄糖对INS-1细胞的激发作用与正常对照组比较,8.4mmol/L～22.4mmol/L浓度的葡萄糖均明显促进INS-1细胞胰岛素的分泌,且与葡萄糖的浓度有关,其中16.8mmol/L是激发INS-1细胞的最佳浓度(P<0.05)。2原花青素对INS-1细胞增殖活力的影响与正常对照组比较,不同浓度原花青素作用12h、24h和48h能促进INS-1细胞的增殖活力(P<0.01),且存在着剂量效应关系；而STZ则抑制了INS-1细胞的增殖活力。与STZ组比较,原花青素(25μg/ml,50μg/ml,100μg/ml)对STZ抑制INS-1细胞的增殖活力有明显的保护和修复作用。3原花青素对INS-1细胞胰岛素分泌的影响与正常对照组比较,原花青素促进了胰岛素的分泌(P<0.01)；而STZ使胰岛素分泌量明显降低(P<0.01)。与STZ组比较,原花青素(25μg/ml,50μg/ml,100μg/ml)修复组和保护组胰岛素分泌均明显增加(P<0.01)4原花青素对INS-1细胞MDA和T-AOC的影响与正常对照组比较,STZ组MDA生成明显升高,而T-AOC活力明显降低(P<0.01)。与STZ组比较,原花青素保护组和修复组MDA生成减少,T-AOC活力明显升高(P<0.01)。说明原花青素对STZ所致INS-1细胞损伤的保护和修护作用机制可能与抑制脂质过氧化物生成,提高总抗氧化能力有关。5原花青素对异搏定和阿托品抑制INS-1细胞胰岛素分泌的影响与正常对照组比较,异搏定、阿托品均明显降低了INS-1细胞胰岛素的分泌(P<0.01)；与异搏定组比较,异搏定+原花青素组胰岛素的分泌量明显增加(P<0.01)；与阿托品组比较,阿托品+原花青素组对胰岛素的分泌作用不明显(P>0.05)。6原花青素对INS-1细胞形态、细胞周期与细胞凋亡的影响倒置显微镜下观察,正常对照组的INS-1细胞大部分呈长梭形、细胞贴壁生长状态较好；而STZ组的INS-1细胞数量减少,细胞形态圆形偏多、细胞的贴壁力减弱,同样,原花青素保护组和修复组的细胞数目相对增多,形态变化不明显。STZ使INS-1细胞G1期比例减少而S期比例增加,原花青素+STZ组细胞周期有所恢复;与正常对照组相比,STZ组的凋亡百分率明显升高(P<0.05),原花青素+STZ组凋亡百分率较STZ组显著下降(P<0.01)综上所述,实验研究表明：1.葡萄糖能激发INS-1细胞释放胰岛素,且与葡萄糖的浓度有关,16.8mmol/L的葡萄糖是INS-1细胞激发的最佳浓度。2.原花青素能增加INS-1细胞的增殖活力和胰岛素的分泌。3.原花青素对STZ所致INS-1细胞的损伤具有一定的保护和修护作用,其机制可能与提高细胞的总抗氧化能力,降低脂质过氧化产物的生成以及抑制细胞凋亡有关。4.原花青素能恢复L-型钙离子通道阻滞剂异搏定抑制的胰岛素分泌,而不影响M受体阻滞剂阿托品的抑制作用。