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目的:探讨创伤性脑损伤(TBI)后PI3K/Akt信号通路参与神经细胞凋亡的分子机制,为临床上早期干预和治疗寻找新靶点,开拓新思路。方法:采用Marmarou方法,用重450g、直径18mm的铜棒从1.2m高度自由落下击中大鼠头部,造成大鼠中度弥漫性创伤性脑损伤。实验动物及分组:SPF级健康雄性SD大鼠210只,体重280±20g,随机分成3组:假手术组(n=42);创伤+DMSO对照组(n=84);创伤+ LY294002干预组(n=84)。每组划分为伤后1h、3h、6h、24h、48h、72h、168h共7个时相点。检测指标及方法:①神经功能损害评分;②HE染色镜下观察脑组织结构及病理形态;③免疫组织化学方法检测p-Akt、NF-κB、Bax的免疫反应性及组织细胞定位情况;④Western-blot法检测p-Akt、NF-κB、Bax的蛋白表达量。另取30只大鼠经过游泳训练后,随机分为假手术组,创伤+ DMSO对照组,创伤+ LY294002干预组,每组10只,进行Morris水迷宫测试检测大鼠伤后学习记忆功能。定量测定:免疫组化阳性细胞阳性度强弱用Image Proplus 6.0数码医学图像分析系统定量分析测定,以积分光密度值(IOD/AREA)来表示;Western blot蛋白定量分析用Image J图像处理软件分析测定,以目标OD值与内参OD值的比值来表示。统计学分析:实验中所得数据均用x±s表示,用SAS V8统计软件进行单因素方差分析,以单侧p<0.05表示差异有统计学意义。结果:1生命体征变化大鼠打击伤后均有尿失禁及肢体肌张力增高表现。60%伤后伴有一侧或双侧瞳孔扩大,持续2-5分钟恢复,50%存在后肢剧烈抽搐,40%存在轻度抽搐、摆尾,持续0.5-1分钟。致伤后多数呈短暂去大脑状态及呼吸抑制,无辅助呼吸条件下,致伤后1-4分钟恢复。本实验大鼠死亡率为8%。2形态学观察结果HE染色光镜结果显示:假手术组大鼠脑组织结构正常,无蛛网膜下腔出血及脑室出血,血管管腔正常,管壁光滑,神经细胞数量多,形态完整。创伤组大鼠脑组织可见不同程度的广泛蛛网膜下腔出血或黄染,血管腔扩大,大脑皮层下广泛组织水肿,毛细血管充血,血管壁增厚,血管腔塌陷,神经细胞变性,大脑皮层与深部白质交界区间隙增宽,组织间质水肿、出血等改变。未见脑实质内出血及挫裂伤。LY294002干预组脑组织病理形态改变较DMSO对照组有不同程度加重(Fig.6)。3神经功能评分结果假手术组大鼠神经功能评分为24分。与假手术组比较,创伤组大鼠在后肢抓持反射、触须诱发前肢定位及侧向垫步试验中均表现异常,评分下降(p<0.05)。LY294002干预组与DMSO对照组比较,在48h、72h、168h神经功能评分下降(p<0.05) (Fig.4-1, 2; Table1)。4 p-Akt免疫组化及Western blot检测结果免疫组化结果显示:p-Akt阳性细胞形态不规则,胞核固缩,阳性产物呈棕黄色颗粒,主要定位于胞浆,少部分定位于胞核。假手术组偶见p-Akt阳性细胞,着色浅淡,免疫反应性不随时间发生变化。在DMSO对照组p-Akt阳性细胞着色呈深棕黄色,在伤后6h表达显著增加,随时间推移阳性细胞逐渐增多,免疫反应性逐渐增强,24h表达达高峰,之后表达逐渐衰减,阳性产物持续表达至伤后168h仍高于假手术组。在LY294002干预组,p-Akt的表达时程与DMSO对照组相似,但各时相点免疫反应性明显减弱(p<0.05)。Western blot检测结果同免疫组化结果(Fig.1-1, 2, 3, 4; Fig.7-1, 2; Table 3-1, 2)。5 NF-κB免疫组化及Western blot检测结果免疫组化结果显示:NF-κB阳性细胞的胞质和/或胞核中弥漫棕黄色颗粒。假手术组NF-κB阳性产物微弱表达,细胞胞浆可见少量棕黄色颗粒,此时NF-κB以无活性的形式存在。DMSO对照组于伤后3h在胞浆和胞核即有阳性表达,此时出现明显NF-κB核转位,并且阳性产物的表达随时间呈上升趋势,免疫反应性在24-48h达高峰,此时细胞质和细胞核均可见到大量棕黄色颗粒,之后表达逐渐衰减,至伤后168h仍有表达且高于假手术组。LY294002干预组中,各时相点NF-κB的阳性表达均较DMSO对照组明显减弱(p<0.05)。Western blot检测结果显示:伤后1-168h,DMSO对照组及LY294002干预组中NF-κB的阳性表达高于假手术组(p<0.05),伤后3h胞浆阳性产物表达明显增强,在6h达高峰,之后开始下降,至168h阳性表达仍高于假手术组水平。此结果与免疫组化结果不符,我们认为出现此情况的原因是NF-κB在伤后3h出现核转位,在24-48h核转位达高峰。伤后1h至168h,LY294002干预组中胞浆NF-κB阳性产物的表达低于DMSO对照组(p<0.05) (Fig.2-1, 2, 3, 4; Fig.8-1, 2; Table 4-1, 2)。6 Bax免疫组化及Western blot检测结果免疫组化结果显示:Bax阳性产物定位于胞浆,呈弥漫或散在的棕黄色颗粒。假手术组中Bax在大鼠脑皮质极少量表达,且不随时间变化。DMSO对照组中伤后6h Bax阳性细胞呈深棕黄色,阳性产物明显增多,免疫反应性于48h-72h达高峰,168h表达下降但仍高于假手术组水平。LY294002干预组中Bax在伤后各时相点的表达较DMSO对照组增强(p<0.05)。Western blot检测结果同免疫组化结果(Fig.3-1, 2, 3, 4; Fig.9-1, 2; Table 5-1, 2)7 Morris水迷宫结果创伤组大鼠在伤后第7-10天搜索安全岛潜伏期较假手术组明显延长(p<0.05)。LY294002干预组大鼠在伤后第7-10天搜索安全岛潜伏期较DMSO对照组明显延长(p<0.05)。另外运动轨迹图象分析显示DMSO对照组大鼠在搜索策略上也较LY294002干预组更为理想(Fig.5-1, 2; Fig.10-1, 2, 3; Table 2)。结论:1创伤性脑损伤后PI3K/Akt信号通路启动了抗神经细胞凋亡的级联反应,p-Akt作用于其下游底物NF-κB和Bax,发挥神经保护作用,这为临床治疗TBI提供了实验理论依据和治疗的新靶点。2创伤性脑损伤后存在明显的神经功能和学习记忆能力障碍,PI3K/Akt信号通路的激活是伤后神经功能和远期学习记忆能力得到改善的机制之一。