格尔德霉素(Geldanamycin, GA)最初在1970年从吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)发酵液中分离得到,属于苯醌安莎霉素。GA具有抗菌、抗原虫、抗炎、抗肿瘤和抗病毒等生物活性。其抗肿瘤作用是近年来关注的热点之一。最初发现GA是蛋白酪氨酸激酶的非特异性抑制剂,后来发现热休克蛋白90(heat shock protein90, Hsp90)是其抗肿瘤作用靶点。GA通过竞争性结合Hsp90N末端ATP/ADP结构域,特异性地抑制Hsp90所必需的ATP酶活性、改变Hsp90构象,从而抑制Hsp90分子伴侣功能。Hsp90失活后,依赖Hsp90的众多蛋白,包括信号转导系统许多重要成员被泛素化和降解,产生抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡等效应。尽管GA有广谱抗肿瘤作用,但由于其水溶性较差,体内分布特异性低,尤其是肝毒性较强,严重影响了其新药开发。为了增加药效、提高成药性和降低毒性,药物化学家们长期对GA进行了结构优化,获得了数百个衍生物,其中17-AAG (Tanespimycin)、17-DMAG (Alvespimycin)、7-AG (IPI-493)和IPI-504(Retaspimycin-HCl)已进入临床试验。17-AAG对多种肿瘤有强的抑制活性,但是由于其昂贵的生产成本、专利期限和肝毒性等问题,施贵宝公司于2011年终止了17-AAG的III期临床试验；17-DMAG由其毒副作用,Kosan Biosciences公司于2008年暂停其I期临床试验；17-AG水溶性和生物利用度都很差,其I期临床试验也被迫暂停；只有IPI-504还在进行治疗KRAS突变的非小细胞肺癌的临床试验。因此,针对现有GA衍生物的毒性和成药性,设计合成GA衍生物,对开发以Hsp90为靶点的新颖抗肿瘤药物有重要意义。本论文分四章,第一章为前言进展,主要介绍Hsp90在肿瘤形成方面的最新研究进展,重点关注了该蛋白的抑制剂GA及其衍生物,主要包括三方面内容：1)Hsp90及其生物化学性质；2)Hsp90及其在肿瘤发生过程中的作用；3)GA衍生物化合物库的构建。第二章为GA荧光探针的设计、合成及其活性研究。随着对GA肝毒性的深入研究,越来越多的研究表明GA引起的氧化应激不依赖于Hsp90,直接通过蛋白质的氧化降解引起细胞损伤和死亡。目前认为GA引起的氧化应激主要包括两个方面：一是诱导细胞产生活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS), GA结构上含有一个苯醌基团,该基团具有氧化性,在黄素酶的作用下发生单电子还原生成半醌阴离子,然后与氧分子反应生成超氧阴离子,这些超氧化物可以进一步转化为其他活性氧自由基。另一方面,研究发现GA在正常生理条件下可以和谷胱甘肽发生加成反应生成稳定的巯基化GA,降低细胞内GSH水平,破坏细胞内氧化还原平衡。为了验证我们的猜想,设计并合成了一系列双机制的H202荧光探针：1)验证GA是否诱导产生活性氧；2)探索GA在细胞内结合的位置。第三章和第四章主要是以GA为骨架进行结构修饰,设计合成7个系列、共146个化合物,并开展了体内外抗肿瘤活性和构效关系研究。在第三章,以GA为先导化合物,分别使用取代的芳基甲胺(A系列)、苯乙胺(B系列)和苯氧乙胺／苯丙胺(C系列)对其17-位进行结构修饰,合成了17-取代芳基甲胺基、17-苯乙胺基和17-取代苯氧乙胺基／苯丙胺基取代3个系列共67个GA衍生物,并对其进行了体内外活性评价和构效关系讨论。17-取代芳基甲胺基-17-去甲氧基格尔德霉素(A系列)衍生物的设计思路是基于17-AAG侧链烯丙胺基的骨架迁越(scaffold hopping),将小π键(双键)替换为大π键(芳环),使用了苄胺基和杂环甲胺基,并考察了芳环上取代基对活性的影响。初步的构效关系研究结果表明,对于抑制MDA-MB-231细胞增殖,大多数17-苄胺基GA衍生物均呈现显著活性,且与17-AAG相当。但是,对于LNCaP细胞株,苯环上不同取代基对活性的影响非常大,且17-(4-氨基苄胺)-17-去甲氧基格尔德霉素(A21)对两株细胞株均呈现显著抑制作用。在GA的17-位引入杂环甲胺来替换取代的苄胺,得到了化合物A30-33。其中,六元杂环衍生物A32-33对两株细胞株都显示出优秀的抑制活性。尤其是17-((6-(三氟甲基吡啶-3-基)甲胺)-17-去甲氧基格尔德霉素(A33),对两株细胞株显示出与17-AAG相当的抑制作用。接着对代表性化合物A21和A32-33进行小鼠体内肝毒性评价,其中化合物A33注射组小鼠的转氨酶水平与溶媒组无显著性差异(P>0.05),暗示化合物A33肝毒性较低。在进一步的体外抗Hsp90实验、细胞内抑制Hsp90实验及体内抑瘤实验中,A33的表现均优于17-AAG。因此,A33的抗肿瘤作用机制和成药性值得深入研究。鉴于A系列衍生物的突出抗肿瘤活性和个别化合物的较低肝脏毒性,并综合17-DMAG和17-AAG的设计思路,合成了26个17-苯乙胺基-17-去甲氧基格尔德霉素(B系列)衍生物。仍然,体外抗肿瘤活性筛选结果表明,B系列化合物的活性要弱于A系列。其中,17-(3-三氟甲基苯乙胺基)-17-去甲氧基格尔德霉素(B25)是B系列中活性最好的一个,其抗前列腺癌细胞的活性(IC50=0.27±0.11μM)优于GA(IC50=0.43±0.15μM)。肝毒性实验表明,B25组与溶媒组小鼠的AST和ALT水平相比,无显著性差异(P>0.05)。综合考虑体外抗肿瘤活性和体外肝毒性结果,化合物B25是一个有潜力的抗前列腺癌先导物。另一方面,通过合成C系列化合物：17-取代苯氧乙胺3/苯丙胺基-17-去甲氧基格尔德霉素衍生物,初步考察取代苯环与GA的C-17取代基链长对GA衍生物抗肿瘤活性和毒性的影响。体外抗肿瘤活性筛选发现,C系列化合物整体的活性与B系列相比有所提高。第四章系统探讨取代芳酰基分别以4种二元胺为连接基团,对GA衍生物抗肿瘤和毒性的影响。在GA的17-位引入4种不同长度的二元胺连接基团,即4-氨甲基哌啶、1,4-丁二胺、1,6-己二胺和3,6-二氧杂-1,8-辛二胺,设计合成四个系列(D、E、F和G系列)共79个新型GA衍生物。起初,我们在GA的C-17位引入连接基团4-氨甲基哌啶、1,4-丁二胺和1,6-己二胺,合成了三个系列的化合物D1-7(4-氨甲基哌啶)、E1-7(1,4-丁二胺)和F1-7(1,6-己二胺),并考查了其对GA衍生物抗肿瘤活性和肝毒性的影响,发现连接基团越长活性越好,并且肝毒性越低。进而我们固定连接基团为1,6-己二胺,考查末端的芳酰基对活性及毒性的影响。通过生物活性筛选发现,末端芳酰基为3,4,5-三甲氧基肉桂酰基时,即17-(1,6-(3,4,5-三甲氧基肉桂酰基)已二胺)-17-去甲氧基格尔德霉素(F36),其对人乳腺癌MDA-MB-231细胞株具有较强的抑制活性,并且肝毒性较低。进一步在GA的C-17位引入更长的连接基团3,6-二氧杂-1,8-辛二胺,设计、合成了26个17-(3,6-二氧杂-8-N-(取代肉桂酰基)辛二胺)-17-去甲氧基格尔德霉素衍生物,并筛选了其对肿瘤细胞生长抑制活性。仍然,构效关系分析表明引入双甲氧基或羟基取代肉桂酰基,GA衍生物的细胞毒性显著降低,活性最好的化合物G21对细胞株MDA-MB-231的IC50也仅为1.5μM。因此,连接基团并非越长越有利于抗肿瘤活性。本学位论文研究结果表明：1)GA的C-17位连接基团为6个原子的1,6-己二胺时,抗肿瘤活性最好,且肝脏毒性较低；2)末端芳酰基为3,4,5-三甲氧基肉桂酰基时,抗肿瘤活性最好,且肝脏毒性较低。17-(1,6-(3,4,5-三甲氧基肉桂酰基)已二胺)-17-去甲氧基格尔德霉素(F36)的体内肝毒性显著低于17-AAG,且体内抗乳腺癌活性优于17-AAG,对于进一步开展GA的结构优化,发展以GA为母核的Hsp90抑制剂,有重要参考价值。