论文部分内容阅读
背景与目的:肺癌是全球男女发病率最高的恶性肿瘤,寻求精准的诊断生物标志物和治疗靶点的识别甚为必要。这些公认的生物标志物包括长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNAs)。LncRNA 序列大于 200bp,常被认为是一类单一的转录本,不具有蛋白质编码能力,但它们可以在DNA-RNA-蛋白质水平上调控分子过程。通过参与表观遗传、转录和转录后机制,在抑癌基因和癌基因表达的调控中起着重要作用。VEGF-A-VEGFR轴在生理和病理血管生成和血管通透性中都是关键的。VEGF-A-VEGFR 轴(VEGF-A、VEGFR-1、VEGFR-2)中仅一个基因的剪接中断就会导致整个信号轴的改变,从而导致癌症中VEGFR-2信号的增加和血管生成异常。本研究我们首先利用基因芯片技术筛选出差异LncRNAs,经RT-PCR技术验证LINC00667在肺腺癌组织标本中高表达,且沉默LINC00667抑制肺腺癌细胞株增殖、迁移,促进凋亡,提示LINC00667为促癌基因,通过生物信息软件分析,提示LINC00667可能与VEGF-VEGFR通路相关,进一步验证LINC00667如何通过与VEGFA的相互作用调控病理性血管生成。本研究结果将为肺癌抗血管生成机制的基础研究及治疗提供新思路。方法:第一部分LINC00667在肺腺癌组织的表达及临床意义方法1.利用基因芯片技术检测3对肺腺癌及癌旁正常肺组织新鲜冰冻标本中lncRNA的表达,筛选出表达明显差异的LncRNA;2.在40例新鲜冰冻腺癌组织及癌旁正常肺组织中利用Real-time PCR方法检测包含LINC00667在内的4个差异LncRNA表达水平;3.检测肺腺癌细胞系及正常肺上皮细胞系中LINC00667表达;4.将LINC00667表达水平与研究对象临床指标相关性进行分析,卡方检验方法研究分析LINC00667表达是否与肺腺癌疾病发展及预后相关。结果1.基因芯片检测初步在肺腺癌及其配对癌旁组织中筛选出有差异表达的LncRNA共800条,生物信息分析筛选后发现其中有显著差异的20条,10条(50%)在肺腺癌组织标本中明显上调,10条(50%)明显下调,LINCOO667在肺腺癌组织标本中表达水平明显增高。2.在肺腺癌与癌旁正常肺组织中利用RT-PCR方法检测LINC00667结果显示,相对于邻近的正常肺组织,LINC00667在85%(34/40)的肺腺癌样本中明显高表达(P<0.05),差异有统计学意义。3.相对于人 IMR90 细胞系,LINC00667 在肺腺癌 H1975,H23,H1299 和 SPC-A1细胞系中表达明显增加(P<0.05),其中在SPC-A1和H1299细胞中的表达丰度均为高,在其余两株细胞中的表达丰度为中。4.LINC00667NSCLC患者的表达水平与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期、脉管系统浸润情况相关(P<0.05),与患者性别、年龄、吸烟史、病变位置无关。第二部分沉默LINC00667抑制肺腺癌细胞增殖、迁移及血管生成方法1.构建沉默LINC00667表达的重组慢病毒载体,对数生长期SPC-A1和H1299细胞分别转染慢病毒表达载体及对照组空质粒载体,RT-PCR检测转染后细胞内LINC00667表达情况。2.利用 Cell counting kit-8(CCK-8)及 EdU analysis 技术,检测沉默 LINC00667对SPC-A1和H1299细胞增殖能力的影响。3.利用Transwell实验检测沉默LINC00667对SPC-A1和H1299细胞迁移能力的影响。4.Tube formation assay血管生成实验检测沉默LINC00667后血管生成情况。结果1.结果显示转染慢病毒表达载体的SPC-A1和H1299细胞系的LINC00667表达量较空质粒对照组明显减少,证实转染率较高,成功获取沉默LINC00667的SPC-A1和H1299细胞株。2.CCK8及EdU analysis实验结果显示在转染慢病毒载体shLINC00667后,细胞增殖能力受到抑制。3.Transwell实验结果显示在转染慢病毒载体shLINC00667后,SPC-A1和H1299穿过基底膜基质的细胞数量明显减少,迁移能力受到抑制。4.沉默LINC00667可以抑制血管生成。第三部分LINC00667通过VEGFA通路促进肺腺癌血管生成方法1.微阵列数据分析(Microarray analysis)与 LINC00667 及 VEGFA 相关的 RNA结合蛋白。2.Real time-qPCR方法检测肺腺癌标本中VEGFA及EIF4A3的表达。3.利用上调VEGFA慢病毒载体(pcDNA3.1/VEGFA)转染SPC-A1和H1299细胞,Tube formation assay血管生成实验检测血管生成情况,采用CCK8、Transwell实验检测上调VEGFA对SPC-A1和H1299细胞增殖、迁移的影响。4.Western-blot 技术检测沉默 LINC00667 对 SPC-A1 和 H1299 细胞中 VEGFA、EIF4A3表达的影响。5.检测沉默EIF4A3对SPC-A1和H1299细胞血管生成、增殖和迁移的影响。结果1.生物信息分析结果显示LINC00667与RNA结合蛋白EIF4A3可以结合。2.肺腺癌组织较癌旁组织中VEGFA、EIF4A3表达升高,沉默LINC00667后,VEGFA表达量明显下降,说明LINC00667与VEGFA有相关性。另外,VEGFA启动子的荧光素酶活性不受影响,LINC00667通过转录后水平影响VEGFA生物活性。3.过表达SPC-A1细胞中VEGFA能促进增殖,迁移,促进血管生成。4.Sh-LINC00667慢病毒载体转染SPC-A1和H1299细胞,VEGFA蛋白表达水平明显下降(P>0.05),EIF4A3表达水平无影响。沉默肺腺癌细胞SPC-A1和H1299中LINC00667能抑制VEGFA的表达,可使与VEGFA结合的EIF4A3蛋白减少。5.加入EIF4A3抑制剂后,SPC-A1和H1299细胞增殖、迁移及血管生成能力减弱。结论:1.LINC00667和VEGFA在肺腺癌中表达水平较高,LINC00667与肿瘤大小、淋巴结转移情况、TNM分期以及脉管系统浸润情况有相关性。2.LINC00667可促进肺腺癌的增殖、迁移及血管生成。3.LINC00667可能通过与EIF4A3结合调控肺腺癌VEGFA的稳定性,促进血管生成,有望成为肺腺癌新的治疗靶标。