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目的:器官移植是解决终末期疾病的有效方法,包括肝移植,肾移植,心脏移植,肺移植等。器官移植面临的问题包括缺血再灌注损伤,免疫排斥,供体不足等。解决免疫排斥的方法是给予免疫抑制剂,免疫抑制剂的应用导致感染以及肿瘤的发生,以及药物的副反应。诱导免疫耐受是移植免疫的终极目标。诱导移植免疫耐受的方法包括阻断共刺激信号通路,微嵌合的形成,调节性细胞的过继输入等。诱导免疫耐受的机制中,Treg细胞占主导地位。间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSC)具有再生能力,是组织工程学的种子细胞,应用于再生医学和缺血性疾病。同时MSC具有免疫调节作用,MSC细胞移植应用于自身免疫性疾病以及骨髓移植,器官移植等领域。没有经过刺激的MSC的免疫调节能力是有限的。MSC通过与多种免疫调节细胞作用发挥作用,包括Treg细胞。为了增强MSC的免疫抑制作用,用TLR3或者TLR4的激动剂预处理的MSC已经应用于多种自身免疫动物模型,比如自身免疫性脑炎(EAE)模型,以及DSS诱导的急性结肠炎模型,但是结果是不尽相同的。所以我们决定在小鼠异位心脏移植模型中观察TLR3和TLR4激动剂预处理的MSC对于急性排斥反应的免疫抑制作用。同时鉴于以往的文献研究,TLR4激动剂LPS预处理的MSC具有免疫增强作用,我们为了获得更强的免疫抑制作用,将TLR3的激动剂poly(I:C)和TLR4阻滞剂TAK242联用,观察是否两种药物的联用可以获得比单药应用起到更强的作用。研究方法:本研究分两部分,第一部分为体外实验:选取了小鼠的脂肪间充质干细胞,一般选用3-6代的细胞,通过形态学,体表标记物的鉴定,以及成脂,成软骨,成骨三系分化来确定脂肪间充质干细胞的身份。一共分为以下组别:ADSC组,TLR3激动剂Poly(I:C)预处理的ADSC组,TLR4激动剂LPS预处理的ADSC组,TLR4阻滞剂TAK242预处理的ADSC组,以及Poly(I:C)联合TAK242预处理的ADSC组。通过在混合淋巴细胞反应中加入TLR激动剂/阻滞剂预处理的脂肪间充质干细胞来检测CD4+T细胞的增值,从而判断不同预处理方式对于脂肪间充质干细胞的作用。通过不同的TLR激动剂/阻滞剂预处理的脂肪间充质干细胞后,检测细胞内的FGL2,Cox-2,IL-10的mRNA以及培养液中FGL2,PGE2,IL-10的含量,进一步验证产生免疫抑制作用的分子。第二部分为体内实验,采用小鼠异位心脏移植模型,术后第一天经尾静脉注射第3-6代的通过TLR激动剂/阻滞剂预处理的脂肪间充质干细胞,观察小鼠移植心脏的存活期,术后第7天获取脾脏,应用流式细胞术分析Treg细胞的比例,以及应用HE染色分析获取的移植心脏的急性细胞性排斥反应的程度,来评估TLR激动剂/阻滞剂对脂肪间充质干细胞的作用。1.研究对象:8～10周龄昆明小鼠、C57BL/6小鼠、BALB/c小鼠,体重20-25g,均为雄性,无特殊病原体(SPF)环境饲养,自由进食、饮水。昆明小鼠100只,C57BL/6小鼠225只,BALB/c小鼠75只,预实验同系异位心脏移植供、受体为昆明小鼠,共50对;预实验同系移植供、受体为C57BL/6小鼠,共50对;正式实验同种异系移植以BALB/c小鼠为供体,C57BL/6小鼠为受体,共75对,另外50只C57BL/6小鼠用于提取ADSC。2.ADSC的提取和培养:根据国际细胞治疗协会分离人MSC的标准,采取C57BL/6小鼠的腹股沟区的ADSC,应用DMEM培养基进行传代和培养,实验采用第3-6代的ADSC。3.ADSC的鉴定:通过形态学,体表标记物CD29,Sca-1,CD34,CD45的鉴定,以及成脂,成软骨,成骨三系分化来确定脂肪间充质干细胞的身份。4.流式细胞术:通过检测FITC抗小鼠CD29,FITC抗小鼠Sca-1,PE抗小鼠CD34,PE抗小鼠CD45,FITC抗小鼠CD4,Alexa Fluor 647抗小鼠Foxp3细胞表面以及细胞核内的表达,鉴定ADSC以及测定Treg细胞的比值。5.ADSC的预处理:短时程处理1个小时,三种试剂分别为TLR3的激动剂Poly(I:C)(10μg/mL),TLR4的激动剂LPS(500 ng/mL),以及TLR4的阻滞剂TAK242(1μM)。6.CD4+T细胞的提取:从C57BL/6小鼠的脾脏提取细胞,应用磁极获取CD4+T细胞,并用CFSE标记,作为混合淋巴细胞反应的效应细胞。7.混合淋巴细胞反应:BALB/c小鼠的脾细胞作为刺激细胞,采用不同的组别预处理的ADSC干预5天,分别采用不同的浓度比例1:0.1,1:0.2,1:1,1:2(CD4+T细胞:ADSC),通过流式细胞术检测CFSE的表达,反应CD4+T细胞的增值。8.PCR:检测不同预处理的ADSC内Fgl2,Cox-2,and IL-10的表达。9.ELISA:检测细胞培养液FGL2,PGE2,IL-10的水平。10.小鼠异位心脏移植:BALB/c小鼠的心脏移植到C57BL/6小鼠的腹腔。简单地说,就是供体心脏的升主动脉和肺动脉分别与受体的腹主动脉和下腔静脉端侧吻合。当恢复血供后,移植心脏恢复跳动。免疫耐受组为分别在术后第0,1,2,4,6,8,10,12,14,16天腹腔注射雷帕霉素诱导耐受。术后第一天给受体小鼠经尾静脉注射0.5×106个ADSC,于第7天取脾脏行流式细胞术检测CD4+Foxp3+Treg细胞的比例,以及获取心脏行HE染色。11.CD4+Foxp3+Treg细胞的测定:行CD4细胞表面染色,以及Foxp3细胞核内染色,应用流式细胞术测定Treg细胞的比例。12.HE染色观察小鼠移植心脏急性细胞排斥反应:心脏移植术后第7天获取移植心脏,进行HE染色,并根据国际心肺移植协会的心脏活检的指南,进行急性细胞性排斥反应的分级。结果:1.通过ADSC形态性,体表标记物的鉴定,以及三系分化鉴定,所提取和培养的细胞为ADSC。2.在混合淋巴细胞反应中,随着ADSC浓度的增加,ADSC对CD4+T细胞的免疫抑制作用增强。3.在混合淋巴细胞反应中,Poly(I:C)预处理的ADSC对于CD4+T细胞抑制作用最强。4.通过PCR以及ELISA方法显示ADSC-poly(I:C)的免疫调节因子FGL2升高最明显。5.Poly(I:C)预处理的ADSC可以延长小鼠移植心脏的寿命。6.Poly(I:C)预处理的ADSC可以增加小鼠心脏移植模型中脾脏CD4~+Foxp3~+Treg的比例。7.HE染色提示ADSC-poly(I:C)处理组的移植心脏的急性细胞排斥反应最弱。结论:1.TLR3激动剂Poly(I:C)在体外和体内均可以显著增强ADSC的免疫调节能力。2.TLR3激动剂Poly(I:C)联合应用TLR4的阻滞剂TAK242并不能进一步增强ADSC的免疫抑制作用。3.注射一次剂量的ADSC可以延长小鼠移植心脏的寿命,但是无法达到耐受,需要进一步调整剂量,频次或者注射途径。4.TLR3激动剂Poly(I:C)可以上调FGL2的表达,FGL2可能是ADSC一个重要的免疫调节因子。