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朊病毒(Prion Disease,PrD),又称为可传播性海绵状脑病(Transmissible Spongiform Encephalopathy,TSE),是一种侵袭人类及其他哺乳动物中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)的传染性、神经退行性疾病,具有潜伏期长和100%致死率的特点。目前人类朊病毒病主要分为:克-雅病(Creutzefeldt-Jakob Disease,CJD)、库鲁病(Kuru)、吉斯特曼-施特劳斯综合症(Gerstmann-Straüssler-Scheinker syndrome,GSS)和致死性家族型失眠症(Fatal Familial Insomnia,FFI),以CJD最为常见。CJD又可分为散发型(sCJD)、医源型(iCJD)、家族或遗传型(fCJD or gCJD)及变异型克-雅病(vCJD)。目前临床检测方法有对患者脑组织进行活检,通过检测血液中PRNP基因突变情况判断遗传型克-雅病,以及检测sCJD患者脑脊液中14-3-3蛋白含量的升高来辅助疾病的诊断。脑组织活检对病人身体损伤极大,根据血液中PRNP基因是否突变只可判断遗传型克-雅病,存在很大局限性,而脑脊液中14-3-3蛋白的检测则特异性不强。因此,临床急需有效的朊病毒病诊断方法。微管由微管蛋白和微管相关蛋白(tau蛋白)组成,其中tau蛋白是含量最高的微管相关蛋白,微管系统是神经细胞骨架成分,可参与多种细胞功能。研究证明,tau蛋白与多种神经性疾病存在紧密联系,并在朊病毒病患者及啮齿动物模型脑组织中明显升高,其中含外显子2(tau-exon 2)和外显子10(tau-exon 10)的特异型tau蛋白占总tau蛋白含量的大部分,因此本研究建立tau蛋白ELISA方法并应用于不同类型的朊病毒病患者脑脊液中。在本研究中,用含有pGEX-2T-E2和pGEX-2T-E10质粒的原核菌体表达出目的蛋白GST tau-exon 2/10,测定目的蛋白浓度,GST tau-exon 2蛋白浓度为0.166μg/uL,GST tau-exon 10蛋白浓度为0.473μg/μL,制备单克隆抗体。制备完成的GST tau-exon 2蛋白单克隆抗体编号为1-4(1.8 mg/mL),4-1(1.7 mg/mL),GST tau-exon 10蛋白单克隆抗体编号为6-4(2.6 mg/mL),5-6(1.8 mg/mL)。用已制备的小鼠单克隆抗体使用蛋白免疫印迹方法分别检测GST tau-exon 2/10蛋白,证明所制备抗体特异性,使用蛋白免疫印迹方法在神经细胞模型和小鼠脑组织分别检测tau蛋白证明抗体敏感性。使用已制备的抗体建立更强敏感性的双抗夹心ELISA方法,最终GST tau-exon 2/10蛋白特异性单克隆抗体双抗夹心ELISA方法的条件确定如下:包被抗体H-150浓度为8μg/ml,检测抗体GST tau-exon 2(1-4)蛋白鼠源单克隆抗体、GST tau-exon 2(4-1)蛋白鼠源单克隆抗体、GST tau-exon 10(6-4)蛋白鼠源单克隆抗体、GST tau-exon 10(5-6)蛋白鼠源单克隆抗体的工作浓度分别选定为1μg/mL,1μg/mL,0.8μg/mL,1μg/mL。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗稀释比例为1:5,000。应用已建立好的双抗夹心ELISA法对包括sCJD、GSS、FFI、T188K位点突变的gCJD及非CJD患者脑脊液中tau-exon 2/10蛋白含量进行检测,结果显示sCJD患者脑脊液中含外显子2的tau蛋白相比于非CJD患者明显升高,具有极显著统计学差异(p<0.001),sCJD患者脑脊液中含外显子10的tau蛋白相比于非CJD患者明显升高,具有显著统计学差异(p<0.01)。T188K位点突变的gCJD患者脑脊液中tau-exon 2/10蛋白含量相对于非CJD患者明显增高,具有显著统计学差异(p<0.01)。而GSS和FFI患者脑脊液中tau-exon 2/10蛋白含量相对于非CJD患者无明显差异,无统计学差异(NS)。本研究建立的特异性tau蛋白双抗夹心ELISA方法可以有效的检测出不同类型朊病毒患者脑脊液中tau-exon 2/10蛋白含量的水平变化,为朊病毒病的检测提供有效的检验方法并对朊病毒病的机制研究提供理论依据。