目的:结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是全球癌症死亡的最常见原因之一,它是美国成人中第四大常见的癌症,也是癌症导致死亡的第二大原因,每年超过50,000人死于结直肠癌。近些年,虽然在结直肠癌的早期诊断和全身治疗方面已有一定进展,但结直肠癌患者的五年生存率仍然仅为50%左右。结直肠癌患者5年生存率低与其化疗抵抗有很大关系,所以关于结直肠癌化疗耐药的相关研究仍是国内外关注的热点。有研究证实脂质代谢重调参与了CRC细胞化疗耐药机制的调控,并在CRC发生发展中起到作用,对预后也有影响。分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediated autophagy,CMA）是第一个被发现的具有严格底物选择性的自噬类型。某些特殊的蛋白质通过其特有的氨基酸序列,即标签,被分子伴侣蛋白所识别并运送到溶酶体中进行降解。CMA在维持细胞蛋白质稳态中起重要作用,还参与了多种肿瘤的发生发展及物质能量代谢。溶酶体相关膜蛋白2A（LAMP2A）是溶酶体膜上一种高度糖基化的跨膜蛋白,它作为CMA的底物蛋白的受体,调节CMA的限速步骤,与CMA活性直接相关,是衡量CMA的功能作用的良好因子。ING5是生长抑制因子家族中的一员,是一种II型抑癌基因,课题组前期研究发现结肠癌中ING5蛋白和mRNA组织含量均升高,其中核中ING5的表达情况与肿瘤的大小、侵袭深度、分化程度、临床病理分期和不良预后呈负相关,而浆ING5的表达则与肿瘤侵袭的深度、淋巴管的侵袭和临床病理分期呈正相关。因此我们认为ING5表达异常和核浆移动在恶性上皮肿瘤发生和演进起到重要作用。同时课题组还发现ING5参与胃癌细胞的脂质代谢重调过程,同时也参与化疗耐药。综合国内外文献报道和前期工作基础,我们提出:LAMP2A上调ING5的蛋白稳定性增加结直肠癌细胞脂滴形成并促进化疗耐药。研究方法:1、LAMP2A通过激活NF-κB通路上调CRC细胞ING5的蛋白稳定性。首先对临床CRC患者的病理组织标本进行Western blot和免疫组织化学染色检测,明确LAMP2A与ING5蛋白表达情况及两者相关性。再通过质粒转染LAMP2A短发夹RNA（shRNA）或转染LAMP2A过表达质粒,降低或升高CRC细胞（HCT116和DLD-1）中LAMP2A的表达水平,Western blot检测ING5蛋白表达情况;利用PDTC（吡咯烷二硫代氨基甲酸铵）或CQ（氯喹）抑制NF-κB信号转导通路或溶酶体通路,Western blot检测ING5的蛋白表达水平;通过CHX（放线菌酮）抑制细胞蛋白质合成,Western blot检测ING5的蛋白表达水平;最后通过免疫共沉淀对结果进行验证。通过Graph Pad Prism 7.0和SPSS24.0对数据进行统计学分析,具有统计学差异标准为P<0.05。2、LAMP2A及ING5表达对CRC细胞脂滴形成的影响。首先研究LAMP2A表达对CRC细胞（HCT116和DLD-1）恶性表型的影响:对稳定转染LAMP2A短发夹RNA（shRNA）或转染LAMP2A过表达质粒的HCT116及DLD-1细胞进行Western blot实验,检测脂质代谢相关酶蛋白（ACC/ACL）、信号转导通路蛋白NF-κB等的表达情况;MTT检测细胞增殖情况;Annexin V-APC/PI双染试剂盒检测细胞凋亡;Transwell法检测细胞迁移和侵袭等。然后通过质粒转染ING5短发夹RNA（shRNA）或转染ING5过表达质粒,降低或升高CRC细胞（HCT116和DLD-1）中ING5的表达水平;继续通过质粒转染在降低或升高LAMP2A表达的HCT116及DLD-1细胞中,降低或升高ING5的表达水平:Western blot检测脂质代谢相关酶蛋白（ACC/ACL）、信号转导通路蛋白NF-κB等的表达情况;尼罗红染色观察细胞中LD情况;最后免疫共沉淀法检测ING5等与脂质代谢相关酶蛋白的相关性。通过Graph Pad Prism 7.0和SPSS 24.0对数据进行统计学分析,具有统计学差异标准为P<0.05。3、LAMP2A及ING5的过表达增加5-FU耐药CRC细胞中脂滴形成并促进耐药。首先建立5-FU耐药CRC细胞株:通过先剂量递增后间断大剂量5-FU处理CRC细胞株HCT116及DLD-1,直至细胞具有耐药性:MTT检测细胞增殖情况并计算IC50和RI;Western blot检测耐药相关基因蛋白表达情况;通过溶酶体示踪染色标记溶酶体,显微镜下观察细胞情况。然后通过Western blot检测LAMP2A、ING5、脂质代谢相关酶蛋白（ACC/ACL）、信号传导通路蛋白NF-κB等表达情况。再通过质粒转染LAMP2A或ING5短发夹RNA（shRNA）,降低5-FU耐药CRC细胞中LAMP2A或ING5的表达水平:Western blot检测脂质代谢相关酶蛋白（ACC/ACL）表达情况平,尼罗红染色观察细胞中LD情况;MTT法检测予以不同化疗药物方案（5-FU,OXA,FOX）处理的细胞的增殖情况。最后采用免疫共沉淀实验检测ING5蛋白、NF-κB蛋白等与耐药相关基因蛋白的相关性。通过Graph Pad Prism 7.0和SPSS 24.0对数据进行统计学分析,具有统计学差异标准为P<0.05。结果:第一部分:1、CRC患者临床病理组织中LAMP2A及ING5表达情况及相关性分析。（1）对95例临床病理组织标本进行Western blot检测:与癌旁正常组织相对比,CRC组织中LAMP2A及ING5蛋白的表达水平均升高,P值<0.05。（2）对425例CRC组织进行免疫组织化学染色检测:与癌旁正常组织及腺瘤组织相对比,CRC组织中LAMP2A的表达水平升高,ING5的表达水平降低,P值<0.05。LAMP2A只表达在细胞质中;ING5则在细胞核及细胞质中均有表达,且癌旁正常组织及腺瘤组织中以细胞核中表达为主,癌组织中则主要表达在细胞质中。总体上LAMP2A及ING5的表达是呈正相关的（Pearson分析,P值=0.000）;细胞核中（Pearson分析,P值=0.000）及细胞质中（Pearson分析,P值=0.009）表达均呈正相关。2、LAMP2A通过激活NF-κB通路上调ING5的蛋白稳定性。（1）对肠癌细胞株HCT15、HCT116、HT29、DLD-1、RKO、SW480、SW620进行Western blot检测,选择LAMP2A和ING5表达量均较高的HCT116细胞株及均略低的DLD-1细胞株进一步实验。（2）通过质粒转染LAMP2A短发夹RNA（shRNA）或转染LAMP2A过表达质粒,降低或升高HCT116及DLD-1细胞株中LAMP2A蛋白表达水平,我们发现ING5蛋白表达水平随着LAMP2A蛋白表达水平的降低或升高而降低或升高,同时信号转导通路蛋白NF-κB的蛋白表达水平也是如此。利用PDTC（吡咯烷二硫代氨基甲酸铵）或CQ（氯喹）抑制NF-κB信号转导通路或溶酶体通路,我们发现与对照组相比较,ING5的蛋白表达量均降低。利用CHX（放线菌酮）抑制细胞蛋白质合成检测ING5蛋白的稳定性,发现LAMP2A过表达的细胞中,ING5的蛋白稳定性增加。通过免疫共沉淀对结果进行验证,我们发现ING5与NF-κB相互作用,HSC70与IκB相互作用。说明CMA通过降解IκB而激活NF-κB通路,ING5通过与NF-κB相互作用维持其蛋白在结直肠癌细胞中的稳定性。第二部分:1、LAMP2A表达对CRC细胞HCT116及DLD-1恶性表型的影响。对稳定转染LAMP2A短发夹RNA（shRNA）或转染LAMP2A过表达质粒的HCT116及DLD-1细胞株进行Western blot检测,MTT检测,APC和PI双染细胞凋亡检测,Transwell检测等,发现:LAMP2A表达降低的HCT116及DLD-1细胞中,脂质代谢相关酶蛋白（ACC/ACL）及信号转导通路蛋白NF-κB表达均降低,细胞增殖减慢,细胞凋亡增多,细胞迁移和侵袭能力减低;反之,在LAMP2A表达升高的HCT116及DLD-1细胞中,脂质代谢相关酶蛋白（ACC/ACL）及信号转导通路蛋白NF-κB表达均升高,细胞增殖速率加快,细胞凋亡减少,细胞迁移和侵袭能力升高。2、LAMP2A及ING5表达对CRC细胞株HCT116及DLD-1中脂滴形成的影响。通过质粒转染ING5短发夹RNA（shRNA）或转染ING5过表达质粒,降低或升高HCT116及DLD-1中ING5的表达水平;继续在降低或升高LAMP2A表达的HCT116及DLD-1细胞株中,降低或升高ING5的表达水平,Western blot实验发现:脂质代谢相关酶蛋白（ACC/ACL）随着ING5表达水平的降低或升高而降低或升高;在双转的细胞株中,LAMP2A及ING5均降低的细胞中脂质代谢相关酶蛋白（ACC/ACL）降低,在LAMP2A及ING5均升高的细胞中脂质代谢相关酶蛋白（ACC/ACL）升高。尼罗红染色直接观察细胞中LD情况与之相符:在LAMP2A和/或ING5降低的细胞中,LD减少;在LAMP2A和/或ING5升高的细胞中,LD增多,差异均具有统计学意义（P<0.05）。证实LAMP2A及ING5均能促进CRC细胞脂质代谢酶（ACC/ACL）的合成,并促进脂滴形成。进一步通过免疫共沉淀实验对结果进行验证:ING5与脂质代谢相关酶蛋白（ACC/ACL）存在相互联系。第三部分:1、5-FU耐药CRC细胞株的建立。通过先剂量递增后间断大剂量5-FU处理肠癌细胞株HCT116及DLD-1,直至细胞具有耐药性,标记为HCT116-R及DLD-1-R:（1）Western blot检测耐药相关基因蛋白表达情况（CD147、LRP1、PGP、GSTπ、MLH1、MRP1蛋白表达水平均升高,FBXW7蛋白表达水平下降）。（2）以不同浓度的化疗药物5-FU（0、1.25、2.5、5、7.5、10、15、20、30ug/m L）对细胞进行处理一定时间（48h）,MTT法检测细胞增殖情况,通过prism 6对数据进行分析计算IC50:HCT116-R为7.22;DLD-1-R为6.7。（3）对相应细胞分别给予不同化疗药物方案,5-氟尿嘧啶（5-FU 10u M）、奥沙利铂（OXA10u M）、FOX方案（5-FU 10u M+OXA 10u M）),处理一定时间（0h、24h、48h、72h、96h）后,利用MTT法检测不同处理条件下细胞增殖情况:5-FU耐药细胞株对奥沙利铂亦具有耐药性。（4）观察耐药细胞:显微镜下耐药细胞体积更大,细胞核更不规则。溶酶体示踪剂染色提示一些耐药细胞的溶酶体更大更多。MTT法检测细胞增殖情况提示耐药细胞的倍增率与亲本细胞株相当,但倍增时间略长。2、LAMP2A及ING5表达对5-FU耐药CRC细胞脂滴形成及化疗药物方案敏感性的影响。（1）Western blot检测HCT116-R和DLD-1-R中LAMP2A和ING5蛋白表达水平,脂质代谢相关酶蛋白（ACC/ACL）表达水平,信号转导通路蛋白NF-κB表达水平等:均升高。（2）通过质粒转染LAMP2A或ING5短发夹RNA（shRNA）,降低耐药细胞株中LAMP2A或ING5的表达水平。通过Western blot检测脂质代谢相关酶蛋白（ACC/ACL）表达水平均降低,尼罗红染色观察细胞中LD均减少。（3）对相应细胞株（敲减LAMP2A或ING5的HCT116-R/DLD-1-R细胞株及过表达LAMP2A或ING5的HCT116/DLD-1细胞株）予以化疗药物方案（5-FU 10u M、OXA 10u M、FOX方案（5-FU 10u M+OXA 10u M））处理一定时间（0h、24h、48h、72h、96h）后,利用MTT法检测不同处理条件下细胞的增殖情况:LAMP2A或ING5表达水平降低的HCT116-R/DLD-1-R细胞中细胞增殖速率明显低于耐药组;相反,在过表达LAMP2A或ING5的HCT116/DLD-1细胞中,细胞增殖速率明显高于对照组及空载组。提示在5-FU耐药CRC细胞中降低LAMP2A或ING5的表达水平,能够增加化疗药物引起的细胞死亡,减少化疗抵抗,增加化疗药物的敏感性。（4）采用免疫共沉淀实验发现:ING5与耐药基因蛋白GST3、CD147相关;NF-κB与耐药基因蛋白GST3、CD147、MLH1等相关。结论:1、与癌旁正常组织相比,结直肠癌组织中LAMP2A及ING5蛋白的表达水平均升高,且呈协同作用。2、LAMP2A通过激活NF-κB通路上调ING5的蛋白稳定性,促进结直肠癌细胞中脂滴形成。3、LAMP2A及ING5降低均能减少5-FU耐药结直肠癌细胞中脂滴的形成,增加化疗药物引起的细胞死亡,减少化疗抵抗,增加化疗药物的敏感性。