【摘 要】
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第一部分:采用CRISPR/Cas9系统构建靶向缺氧诱导因子-1α基因敲除质粒及功能验证研究目的:采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建靶向HIF-1α基因敲除质粒并通过敲除HEK-293细胞的HIF-1α基因验证其功能。研究方法:通过在线软件设计靶向HIF-1α的3号外显子的sgRNA。合成寡核苷酸,退火;再用BsmBI限制性核酸内切酶酶切Lenticrispr V2形成线性载体,用DNA连
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第一部分:采用CRISPR/Cas9系统构建靶向缺氧诱导因子-1α基因敲除质粒及功能验证研究目的:采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建靶向HIF-1α基因敲除质粒并通过敲除HEK-293细胞的HIF-1α基因验证其功能。研究方法:通过在线软件设计靶向HIF-1α的3号外显子的sgRNA。合成寡核苷酸,退火;再用BsmBI限制性核酸内切酶酶切Lenticrispr V2形成线性载体,用DNA连接酶将线性载体和退火的寡核苷酸连接构成重组质粒。测序验证重组质粒构建正确后,将其命名为Lenticrisprv2-HIF-1α。将重组质粒经脂质体转染法转染到HEK-293细胞中,经嘌呤霉素药物筛选后,扩大培养多克隆HEK-293细胞株。提取多克隆HEK-293细胞株的DNA和蛋白,用T7E1酶和Western blot检测基因变化和蛋白表达。结果:（1）测序结果显示,所设计的sgRNA成功插入到了Lenticrispr V2载体中,测序序列正确,重组质粒构建成功。（2）药物浓度筛选试验确定嘌呤霉素浓度2.0μg/mL为筛选的最佳浓度。（3）T7E1酶切实验成功切出三条条带,计算sgRNA的打靶效率为33.8%。（4）Western blot结果显示经过氯化钴诱导的转染药筛后的HEK-293细胞的HIF-1α蛋白表达水平较野生型细胞显著下降（P＜0.05）。结论:成功构建了靶向HIF-1α基因的CRISPR/Cas9载体,载体靶向敲除HIF-1α基因功能验证成功。第二部分:病例展示:牙周内窥镜辅助下的牙周基础治疗病例6例研究目的:展示牙周内窥镜辅助下的牙周基础治疗病例,探讨牙周内窥镜辅助下的牙周基础治疗疗效研究方法:本研究为病例展示,研究对象为符合新分类Ⅱ-Ⅳ期诊断的牙周炎患者,排除禁忌症,患者将接受牙周内窥镜辅助下的牙周基础治疗。在初诊和术后三个月随访时,采集患者口内照及患者视觉评分量表,使用佛罗里达牙周探针及量表记录牙周临床指标并分析。牙周临床指标包括菌斑指数、探诊后出血、探诊深度、松动度和根分叉病变等指标。视觉评分量表包括疼痛度VAS和满意度VAS来对患者进行治疗的主观评价。所有患者均行完善全口超声龈上洁治术和牙周内窥镜辅助下的龈下刮治术和根面平整术,术后进行口腔卫生宣教。数据均使用SPSS 17.0软件进行统计学分析。结果:（1）本研究纳入牙周炎Ⅱ-Ⅳ期患者6人,平均年龄44.50±13.46岁,均无影响牙周愈合的系统性疾病。（2）患者初诊时牙周探诊深度≥4mm位点占全口位点比例在30.4%-69.1%之间,平均占比51.08±16.80%。BOP阳性位点占比12.6%-100%,平均45.97±30.51%。治疗时患者疼痛度VAS平均评分3.50±0.55。患者满意度VAS评分平均8.33±0.75。（3）患者术后三个月牙周探诊深度≥4mm位点比例在3%-41.4%之间,平均占比16.88±15.15%。除5号患者外,所有患者牙周探诊平均深度＜3mm。BOP阳性位点占比6.3%-16.7%,平均11.42±3.62%。患者菌斑指数均有不同程度的下降。初诊时的松动牙和根分叉病变在术后三个月检查时也出现了好转。术后三个月患者疼痛度VAS评分除4号外均为零,患者满意度VAS评分均为10。（4）所有患者在经过牙周内窥镜的辅助下基础治疗三个月后,牙周探诊深度≥4mm位点占比较初诊时均有显著下降（P＜0.001）。所有患者牙周基础治疗前后平均探诊深度也有不同程度地显著降低（P＜0.001）。除1号患者外所有患者牙周治疗后BOP阳性位点占比较初诊时有显著下降（P＜0.001）。其中4号患者降幅最为明显,达83.3%。结论:本研究纳入的患者在的随访期间均取得了良好的疗效,内窥镜辅助下的牙周基础治疗短期治疗效果明显,在一定程度上可以避免牙周手术治疗,减少患者对面手术时的恐惧和焦虑,值得在临床上推广使用。
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