马克斯克鲁维酵母菌（Kluyveromyces marxianus）具有代谢底物广、耐热性好及比生长速率快等多种优良特性，并且能合成大量的乳糖酶、菊粉酶、β-葡萄糖苷酶和其它酶，因而引起国内外学者的广泛关注。与其它种类的微生物相比，该酵母菌是一类在食品工业中普遍采用的微生物，用作酶源非常合适。微生物中普遍存在葡萄糖阻遏现象，当有葡萄糖存在时，许多酶的合成和基因表达都会受到抑制。参与葡萄糖阻遏作用的主要为Snf1复合体和Mig1蛋白，当培养基中葡萄糖浓度较高时，Snf1复合体去磷酸化，Snf1复合体失去活性，这时Migl由于不能被磷酸化，进入细胞核中与受葡萄糖阻遏基因的启动子结合，使基因表达受到抑制，说明Mig1在菌株的酶合成和调控中起重要的作用。如果将编码Mig1的MIG1基因敲除，相关基因的阻遏效应解除。因而本研究通过基因敲除法阻断K. marxianus km菌株MIG1基因，然后研究该基因的敲除对该菌株酶的合成和相关基因的表达产生的影响。首先利用编码潮霉素的HPT基因的ORF替换km-15菌株的MIG1基因的ORF，在含有潮霉素的YPD平板上筛选获得了敲除菌株km-15，它能在含有2-脱氧-D-葡萄糖的乳糖培养基平板上生长，而野生型菌株km则都不能，表明敲除菌株葡萄糖阻遏作用解除。与野生型菌株km相比，敲除菌株km-15的乳糖酶、菊粉酶和β-葡萄糖苷酶的产量均有很大提高，同时编码这些酶基因的表达量也有极大提高。这表明，K. marxianus km中的Mig1确实能阻遏某些基因的表达，对一些酶的合成具有调控作用。对敲除菌株km-15产乳糖酶培养基进行了优化，确定了最佳培养基成分为（w/v）：乳清粉10.0%、酵母粉1.5%、蛋白胨1.0%和MnCl21.0mM。在28°C、pH7.0条件下180rpm振荡培养48h，km-15菌株乳糖酶产量为111.7U/mL。经过2-L发酵罐发酵，该菌株乳糖酶产量提高到121.7U/mL。同时，确定了酶法水解乳糖的适宜条件，即乳糖浓度9.0%（w/v）、乳糖酶使用量为440U/g乳糖、40°C、pH7.0和水解时间2.5h，在这种条件下乳糖水解率为99.2%。在同样条件下，12.0%（w/v）的乳清粉经过该酶水解3.5h后，乳清粉中乳糖水解率为98.7%。调节乳糖酶使用量为260U/g乳糖添加到5.0mL牛奶中，水解3.0h后，牛奶中乳糖水解率为99.3%。将上述水解液进行薄层层析，结果显示水解产物只有单糖，即葡萄糖和半乳糖，其中的乳糖完全水解，表明该乳糖酶在食品工业中具有潜在的应用价值。就上面所说的那样，该酵母菌还产菊粉酶。对敲除菌株km-15产菊粉酶培养基进行了优化，确定了最佳培养基成分为（w/v）：菊粉8.0%、酵母粉3.0%，在28°C、pH4.5的条件下180rpm振荡培养42h，km-15菌株菊粉酶的活力为69.0U/mL。分别以菊粉和菊芋汁作为碳源，经过2-L发酵罐发酵，发酵48h和60h后，菊粉酶活性分别为79.9U/mL和73.3U/mL。然后，确定了酶法水解菊粉的适宜条件，即菊粉浓度6.0%（w/v）、菊粉酶使用量为400U/g菊粉、50°C、pH4.5、水解时间3.0h，菊粉水解率为96.2%。将其水解产物进行薄层层析分析，水解终产物以单糖为主，仅有少许寡糖，表明km-15菌株所产菊粉酶为外切菊粉酶。本实验室自南极海洋沉积物中分离出1株耐冷酵母Guehomyces pullulans17-1菌株在15°C可同时产胞外和与细胞结合的乳糖酶。故采用NTG对G.pullulans17-1菌株进行诱变，结合X-gal显蓝斑和发酵培养测定的选育方法，获得乳糖酶活力达24.8U/mL且遗传稳定的突变菌株NTG-133，产量比野生型菌株（13.9U/mL）提高近一倍。对突变菌株NTG-133产乳糖酶培养基进行了优化，确定了最佳培养基成分为（w/v）：乳清粉4.0%、蛋白胨1.0%、酵母粉0.5%，于15°C、pH4.5条件下，170rpm振荡培养132h，乳糖酶活达38.0U/mL。采用发酵罐发酵产酶，乳糖酶活提高到48.1U/mL。然后，确定了酶法水解乳糖的适宜条件，即乳糖浓度9.0%（w/v）、乳糖酶的使用量为550U/g乳糖、40°C、pH4.0、水解时间6.0h，乳糖水解率为91.8%。在最适水解条件下，12.0%（w/v）的乳清粉，水解7.5h后，乳清粉中乳糖水解率为88.3%。将上述水解液进行薄层层析分析，结果显示水解产物主要是单糖，即葡萄糖和半乳糖，但没有水解完全，仍有残留乳糖存在。