目的近年来气道上皮的功能逐渐引起人们的关注。人们开始认识到气道上皮不仅仅是一个能隔离外界环境中微粒和气溶胶的机械屏障,还是一层粘膜免疫屏障,是对抗环境中的损伤如病毒和颗粒性物质的第一线结构性细胞防御机制。正常情况下,气道上皮主要是保持气道开放以及结构完整,从而保持局部微环境的稳态。当气道受到过敏原、病毒和物理性损伤等刺激时,气道上皮细胞既能作为靶细胞受到外源性物质的影响,也作为效应细胞,通过合成和表达一系列分子,包括粘附分子以及可溶性分子如细胞因子和趋化因子等来参与天然免疫反应。然后,天然免疫反应的活化引起免疫细胞聚集到气道上皮,启动获得性免疫反应。越来越多的人认识到气道上皮细胞在气道天然免疫和获得性免疫以及粘膜炎症中发挥着核心作用。粘附分子在气道上皮细胞上的正常表达对于保持气道微环境稳态至关重要。细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule, ICAM-1)是免疫球蛋白基因超家族的一个成员,是气道上皮反应的一个重要组成部分。ICAM-1是诱导免疫反应和炎症病理机制的基本组分,通过与白细胞表面的相应配体结合,介导白细胞渗出。ICAM-1还具有信号分子的功能,传递胞外一胞内信号,产生大量的生物学效应,如诱导胞内蛋白磷酸化,使蛋白激酶和转录因子活化。另外,粘附分子在介导气道上皮细胞之间以及细胞与基质蛋白之间的连接中发挥重要作用。E-cadherin属于钙粘素分子家族,是一种同亲型结合、钙依赖性细胞粘着糖蛋白,通常表达在上皮细胞。α-、β-、γ-连环蛋白(catenin)能与E-cadherin胞浆区结合并将其连接至肌动蛋白细胞骨架,维持细胞结构的稳定。E-cadherin介导的粘着连接(adherens junctions, AJs)断裂与上皮完整性丢失有关。有研究表明,用抗体选择性阻断E-cadherin能减小原代培养的气道上皮跨上皮电阻达80%以上,提示E-cadherin对于保持气道上皮屏障完整的重要性。呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus, RSV)是世界范围内儿童流行性呼吸道疾病以及婴幼儿、老年人和免疫功能低下患者细支气管炎和肺炎的首要发病原因。世界卫生组织2009年9月更新的数据显示,病毒感染引起的呼吸道疾病中RSV感染占据首位。全球每年由RSV感染引发的病例约达6400万,并引起约16万人死亡。RSV主要感染气道上皮细胞并在细胞内进行复制,引起气道上皮细胞坏死、脱落以及粘膜腐脱,伴随大量的炎症介质释放,启动免疫和病理反应,使气道上皮结构遭到破坏和功能发生缺陷,成为引起RSV相关疾病的始动环节。RSV感染诱导气道上皮细胞产生一系列基因和／或基因产物,如ICAM-1、细胞因子、趋化因子和其他炎症介质等发挥宿主防御功能,启动抗病毒和炎症反应。同时,RSV感染能引起气道上皮损伤,上皮顶端连接复合物断裂以及肌动蛋白细胞骨架重构,跨上皮电阻减小,提示气道上皮的完整性遭到破坏。另一方面,呼吸道合胞病毒也拥有许多可表达的基因,能对抗Ⅰ型干扰素作用和其他有关的宿主抑制病毒复制的途径。病毒感染通过对宿主蛋白功能的特异拮抗作用、RNA应激颗粒的诱导以及宿主基因表达模式改变的诱导,能改变宿主基因的转录以及宿主转录本的翻译。可见,上皮细胞与RSV之间的相互作用是一个动态的过程,即疾病持续或病情进展依赖于上皮细胞是否能有效清除病毒。RSV感染除了会引起急性临床症状外,还认为其与一些长期存在的并发症有关,如反复发作的哮喘和哮喘病。在急性症状治愈之后,RSV感染引起的长期存在的气道功能不全机制,目前尚不清楚。综上所述,我们推测RSV急性感染后长期存在的气道功能不全可能与气道上皮细胞粘附分子表达异常从而危害气道上皮屏障功能有关。为了揭示RSV感染对气道上皮的长期影响,本课题利用一种转化的人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial cells)——16HBECs,试图探讨RSV能否感染16HBECs持续至若干代,在此基础上观察细胞炎症粘附和基质粘附功能的动态变化,并初步探讨其分子机制,对揭示RSV急性感染后长期存在的气道功能障碍发展规律具有重要作用,也有可能为其治疗提供新的思路。研究内容如下：(1)利用16HBECs建立RSV长期感染模型,分析RSV在16HBECs中的复制情况以及细胞对RSV感染的敏感性。(2)利用建立的RSV体外感染16HBECs持续4代模型,观察RSV感染后16HBECs炎症粘附功能和基质粘附功能的动态变化。(3)分析ICAM-1和E-cadherin对RSV感染后16HBECs粘附功能的影响,初步探讨粘附功能改变的分子机制。方法与结果1.建立人支气管上皮细胞株16HBECs RSV长期感染模型分别用感染复数(multiplicity of infection, MOI)为0.00025、0.0005、0.0010、0.0067、0.0134、0.0268和0.0536的RSV (A2株)感染16HBECs,观察不同MOI对细胞传代、细胞病变和RSV病毒复制的影响。结果显示,当RSV在MOIs≤0.0010感染16HBECs时,光镜下偶见第3代(generation, G)和G4极少量合胞细胞；G1细胞中能检测到RSV RNA,G2开始至G20Real-time PCR结果均显示RSV核酸阴性。当RSV在MOI=0.0067感染16HBECs时,有时G2或G3细胞死亡或病毒被清除；但多数情况下(约80%)细胞能传至G4,此时G1、G2未见明显的细胞形态变化,G3可见少量小的合胞细胞和形状不规则细胞,G4可观察到大的合胞细胞以及细胞数量减少,G5则以裂解细胞为主,伴随一些合胞细胞及散在的细胞贴在培养瓶／皿上,细胞很快死亡；核酸检测结果与之相符,G2细胞RSV RNA即为阳性,且传代过程中GT值逐渐减小。RSV在MOIs≥0.0134感染16HBECs时,G3即可见大量合胞细胞,引起细胞大量死亡；此时G2细胞RSV核酸检测即为阳性,且传代过程中的CT值逐渐减小。因此,后续实验选用RSV在MOI=0.0067感染16HBECs,传至第5代细胞死亡时,用G1至G4细胞进行分析。第一部分结果说明16HBECs对RSV A2特别敏感,当细胞单层培养时,病毒能在细胞内进行有效复制。我们建立了一个RSV (A2株)体外感染16HBECs持续4代模型,可用于分析细胞的炎症粘附和基质粘附情况。2.RSV感染后16HBECs炎症粘附和基质粘附功能的动态变化利用RSV (A2株)体外感染16HBECs持续4代模型,观察细胞炎症粘附和基质粘附功能的动态变化。结果显示,RSV感染后,能够上调一系列细胞因子和趋化因子的分泌。白细胞介素(interleukin,IL)-6从G2至G4进行性升高；IL-1β、IL-8、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-a和巨噬细胞炎症蛋白(macrophage inflammatory protein, MIP)-1α在G3和G4升高；而干扰素-γ诱导蛋白(interferon-y-induced protein, IP)-10仅在G4升高。这些细胞因子和趋化因子的分泌均在G4达到高峰,且其分泌量为G3细胞的数倍至数十倍。RSV感染后,G1细胞和正常细胞比较,与白细胞的粘附率无显著差异；但从G2开始显著并逐步升高,G4达高峰。同时分析细胞的基质粘附功能发现,16HBECs G1和G2与正常对照组相比,细胞的基质粘附率没有显著差异；而G3和G4细胞与基质的粘附率显著下降。第二部分的结果说明RSV感染16HBECs初期细胞的炎症介质分泌量、炎症粘附功能和基质粘附功能均没有明显变化,提示轻微RSV感染早期是疾病控制和预防的最好时机。但在RSV长期感染过程中,16HBECs细胞因子／趋化因子的分泌显著增加、白细胞粘附功能显著增强而基质粘附能力显著下降,且均在G4达到高峰。提示RSV感染引起16HBECs发生一系列复杂的事件,引起了炎症反应的动员和上皮完整性的丢失,这种上皮功能和结构完整性的缺陷,是引起细胞死亡的根本原因。3. ICAM-1和E-cadherin对RSV感染后16HBECs粘附功能的影响在检测RSV感染后16HBECs粘附分子ICAM-1和E-cadherin表达情况的基础上,利用抗体阻断实验观察它们对RSV感染后16HBECs粘附功能的影响。结果显示,RSV感染后,除G1细胞外,ICAM-1mRNA和蛋白表达水平均显著升高,G4达到高峰(分别为正常对照组的6.3和6.7倍)。全细胞半定量测定也证实了这一结果,除G1细胞外,ICAM-1的表达水平显著升高,G4达到高峰(约为正常对照组的22.9倍)；可溶性ICAM-1(soluble ICAM-1, sICAM-1)在G1和G2均未见明显升高,而G3和G4细胞分泌sICAM-1显著增加,G4达到高峰(约为正常对照组的25.2倍)。RSV感染后,从G1开始,16HBECs E-cadherin基因CDH1mRNA的表达水平即显著升高,到G3达到高峰(约为正常对照组的12.4倍),但G4有所下降。与正常对照组相比,G2和G3细胞E-cadherin蛋白表达水平显著升高,但G4显著下降,Western blot法几乎不能检测到E-cadherin蛋白的存在。抗体阻断实验结果显示,与G3对照组相比,ICAM-1中和抗体能显著抑制RSV诱导的16HBECs TNF-β的分泌,而对IL-1β、 IL-6、IL-8、MP-1α和IP-10的分泌没有显著影响；ICAM-1中和抗体还能显著降低16HBECs与白细胞的粘附率；而用抗体选择性阻断E-cadherin能显著抑制16HBECs与基质的粘附。第三部分结果说明RSV长期感染引起16HBECs粘附分子ICAM-1和E-cadherinr的表达发生异常改变,参与了细胞炎症反应的动员以及上皮完整性的丢失。结论本研究首次探讨了呼吸道合胞病毒A2株体外持续感染16HBECs的可行性,发现人支气管上皮细胞(16HBECs)对RSVA2株特别敏感,建立了一个RSV (A2株)体外感染16HBECs持续4代模型。基于此模型的进一步研究发现,在RSV长期感染过程中,病毒引起了细胞粘附分子表达的改变、炎症反应的动员和细胞脱落,从而导致了细胞的死亡,导致炎症介质活化和细胞脱落机制的阐明将能帮助我们进一步了解RSV急性感染后长期存在的细胞反应,对揭示长期存在的气道功能障碍发展规律具有重要作用。因此,我们推测RSV感染后长期存在的气道功能不全可能与气道上皮细胞粘附分子表达异常从而危害气道上皮屏障功能有关,提示将粘附分子作为RSV急性感染后长期存在的气道功能不全的治疗靶标具有可行性。