目的:阿尔茨海默病(AD)的临床表现为进行性记忆力丧失和认知能力减退,最核心病理特点为β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积形成老年斑,Aβ1-42是形成老年斑的主要成分,并且由Aβ沉积引发的免疫炎症反应在AD神经变性过程中起着核心作用。Aβ疫苗免疫治疗AD的机制就在于调控免疫炎症级联反应,多项研究提示Aβ疫苗接种能降低AD样病理和改善认知障碍,但是当Aβ全肽段疫苗用于人类Ⅱ期临床试验时,因出现了致命的T细胞介导的脑膜脑炎被终止;Aβ1-42 N末端片段Aβ1-42含激活B细胞的抗原决定簇,不诱发炎症反应,选用Aβ1-42 N末端片段为抗原,避开了全肽段Aβ1-42的C末端的毒性肽,可以预防和治疗AD,又避免诱发炎症反应。本研究采用已经构建的Aβ3-10重复10次片段的质粒免疫正常Balb/c鼠及Tg-APPswe/PSEN1dE9鼠,检测Aβ3-10重复片段疫苗是否具备免疫原性,对Tg-APPswe/PSEN1dE9鼠学习及记忆能力的改善、脑内Aβ沉积清除的影响、体外脾T淋巴细胞增殖反应及分泌细胞因子的影响、脑内胶质细胞激活状态及形态的变化与A B沉积的关系,阐述Aβ3-10重复片段质粒疫苗免疫治疗Tg-APPswe/PSEN1dE9鼠的效果及对炎症反应的调节作用。　　 方法:　　 质粒菌液由导师提供,提取质粒pcDNA3.1+-Aβ(3-10)10-CpG、酶切反应、测序。正常Balb/c鼠及12月龄Tg-APPswe/PSEN1dE9鼠随机分3组:Aβ1-42组、Aβ3-10组只、对照组。正常Balb/c鼠按照0、2、4、8周免疫4次,12月龄Tg-APPswe/PSEN1dE9鼠按照0、1、3、6、9、12周共免疫6次。通过眶后及腹主动脉,其中每组2只小鼠的新鲜脾脏用于细胞培养;分离小鼠大脑左右半球,左侧大脑半球-70℃保存待检;右侧半球及分离后肺、肝、心脏、脾和肾脏等组织放入75％乙醇-甲醛中固定。检测尿样的胆红素、酮体、维生素C、尿蛋白、潜血、pH、白细胞、比重等指标。采用Morris水迷宫测试小鼠的空间学习记忆能力,分为隐藏平台获得实验和空间探索实验两部分,记录轨迹、潜伏期时间、穿过平台次数、穿越第Ⅰ象限次数、游泳距离、平均速度,和站台周边区域、站台周边区域一及中央游泳距离占总距离百分比等。采用ELISA方法检测血清抗Aβ抗体。采用MTT法测定体外脾T淋巴细胞增殖反应,采用ELISA检测细胞培养上清及脑组织匀浆中的IL-4、IFN-γ水平。HE染色及普鲁士蓝染色检测脑、肺、肝、心脏、脾和肾脏等组织。采用采用免疫组化SP法,检测脑内Aβ沉积及抗GFAP阳性细胞。应用SPSS16.0软件,多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用独立样本的t检验,数据采用均数±标准差,差异显著水平设为p＜0.05。　　 结果:　　 酶切及测序结果提示Aβ3-10重复10次片段与载体pcDNA3.1及真核表达增效剂CPG成功连接。免疫正常Balb/c鼠,第3次及第4次免疫后就检测出抗Aβ抗体,抗体水平随免疫次数增多而增加。Morris水迷宫实验提示Aβ3-10重复片段质粒与Aβ多肽免疫治疗较对照组明显改善学习及记忆能力,Aβ3-10组的总平均潜伏期、穿平台次数及穿越第一象限次数都优于Aβ1-42组,但差异不显著。免疫过程血清抗Aβ抗体水平检测显示Aβ1-42组和Aβ3-10组的抗体水平随着免疫接种次数增多逐渐增高,第3次及第4次免疫接种后抗体水平上升明显,之后2次免疫后血清抗体水平非常接近。尿液检测、HE及普鲁士蓝染色显示Aβ3-10重复片段质粒疫苗没有明显的副作用。免疫组化提示免疫治疗后Tg-APPswe/PSEN1dE9鼠海马及皮层区平均Ap沉积所占面积百分比依次为:对照组＞Aβ1-42组＞Aβ3-10组＞C57BL/6J组,皮层区＞海马区。体外脾T淋巴细胞增殖反应显示当Aβ1-42组及Aβ3-10组分别给予其相对应的免疫抗原刺激时能产生增殖率高(p＜0.05),并且高于ConA刺激产生的增殖率;当分别给予非对应免疫抗原刺激时,产生的增殖率低于阳性对照ConA刺激产生的增殖率(p＞0.05);在对照组中Aβ(3-10)4多肽和Aβ1-42多肽刺激产生的增殖率都明显低于ConA刺激产生的增殖率(p＜0.05)。细胞因子检测提示只有在增殖反应中给予相对应的免疫抗原才能检测到较高水平的IL-4、IFN-γ(p＜0.01),并且β3-10组IFN-γ水平低于Aβ1-42组(p＜0.05)。脑组织匀浆中IL-4、IFN-γ水平在Aβ1-42组、Aβ3-10组及对照组之间比较无差异(p＞0.05),但显示了依次递减的趋势。免疫组化结果提示GFAP表达阳性的细胞所占面积百分比依次为:对照组＞Aβ1-42组＞Aβ3-10组＞C57BL/6J组(p＜0.05),皮层区＞海马区(p＜0.05),被激活的AC数量及分布与Aβ沉积数量及分布部位呈明显相关性,并且GFAP阳性细胞分布于Aβ沉积形成的老年斑的周围及内部,对Aβ沉积呈现明显的趋向聚集现象。　　 结论:　　 Aβ3-10重复10次片段与载体pcDNA3.1及真核表达增效剂CPG成功连接,提示构建质粒pcDNA3.1-(Aβ3-10)10-CPG成功。Aβ3-10重复片段质粒疫苗肌肉注射免疫Balb/c鼠,在小鼠体内检测到抗Aβ抗体,并且抗体滴度随免疫次数增高而增加,提示具备免疫原性。　　 Aβ3-10重复片段质粒疫苗免疫Tg-APPswe/PSEN1dE9鼠同样具有较好的免疫原性,无明显副作用。Aβ3-10重复片段质粒与Aβ多肽免疫治疗改善学习及记忆能力相似。Aβ3-10组的总平均潜伏期、穿平台次数及穿越第一象限次数都优于Aβ1-42组,虽然差异不显著,但仍可显现Aβ3-10重复片段质粒疫苗免疫对12月龄Tg-APPswe/PSEN1dE9鼠行为学改善略强于Aβ1-42组的趋势。各组之间的Aβ沉积量及分布变化充分显示Aβ3-10重复片段质粒疫苗及Aβ多肽疫苗免疫治疗有效,并且Aβ3-10重复片段质粒疫苗免疫清除Aβ沉积效果优于Aβ多肽疫苗。　　 Aβ3-10重复片段质粒免疫虽然也可以产生T细胞介导的细胞免疫,但不会产生与Aβ1-42多肽免疫所产生的相同的致命的T细胞介导的细胞免疫。Aβ3-10重复片段质粒免疫及Aβ1-42多肽免疫诱导Th2细胞免疫程度相当,但Aβ3-10重复片段质粒免疫与Aβ1-42多肽免疫相比较:下调了Th1细胞免疫,减少了非特异性的细胞毒性的T细胞免疫,并且降低了炎性细胞因子IFN-γ的分泌。免疫组化结果提示Aβ沉积诱发了Tg-APPswe/PSEN1dE9鼠脑内炎症级联反应,被激活的AC数量及形态与Aβ沉积量正相关,随着Aβ沉积清除数量增多而增多,并且随着脑内Aβ沉积量的减少,脑内被激活的AC又逐渐恢复静息状态。提示Aβ3-10重复片段质粒免疫清除Aβ沉积同时降低了对AC的炎症刺激。