【摘 要】
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猕猴桃根癌病（Kiwifruit crown gall）是一种由细菌引起的猕猴桃根部病害,可造成猕猴桃根系组织膨大畸形,影响猕猴桃营养吸收和正常生理功能,严重时可导致植株死亡。本研究以猕猴桃根癌病为研究对象,采用组织分离法对猕猴桃根癌病病原菌进行分离纯化,通过致病性测定、形态学观察、生理生化及分子生物学分析等,明确猕猴桃根癌病的病原菌种类,并采用基因组特异性基因建立猕猴桃根癌病的PCR检测体系和环
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猕猴桃根癌病（Kiwifruit crown gall）是一种由细菌引起的猕猴桃根部病害,可造成猕猴桃根系组织膨大畸形,影响猕猴桃营养吸收和正常生理功能,严重时可导致植株死亡。本研究以猕猴桃根癌病为研究对象,采用组织分离法对猕猴桃根癌病病原菌进行分离纯化,通过致病性测定、形态学观察、生理生化及分子生物学分析等,明确猕猴桃根癌病的病原菌种类,并采用基因组特异性基因建立猕猴桃根癌病的PCR检测体系和环介导等温扩增（LAMP）技术,为猕猴桃根癌病的早期诊断提供技术支撑。主要研究结果如下:（1）通过形态学观察、生理生化反应及分子生物学技术,结合16S r DNA和Rec A-gyr B-atp D-rpl B多基因序列分析,明确了贵州猕猴桃根癌病致病菌为Agrobacterium fabacearum;生物学特性研究表明,A.fabacearum.最适碳源为阿拉伯糖、氮源为磷酸氢二铵、无机盐为磷酸氢二钾,最适温度为28℃、p H为8.0,接种量为5%。（2）通过基因组比对,筛选并确定了Aar F/R和Afa F/R为最佳引物,建立猕猴桃根癌病菌的PCR检测技术,结果表明,对于土壤杆菌属中的近源种及猕猴桃根癌病发生地健康土壤中分离的菌株均无特异性扩增,猕猴桃根癌病致病菌（A.fabacearum）扩增出特异性条带。引物Aar F/R最适退火温度为53℃,循环次数35次,优化后的Aar F/R引物DNA检测限度达5×10-2 ng/μL;Afa F/R引物的最佳退火温度和循环次数为55.9℃和40次,最低检测浓度达5×10-3 ng/μL。将Aar F/R和Afa F/R两对引物对田间样品进行检测,结果显示,发病土壤和发病组织的基因组DNA扩增出特异性条带,健康组织和健康土壤均无特异性扩增,表明Aar F/R和Afa F/R引物具有较强的特异性,可用于猕猴桃根癌病的早期诊断。（3）猕猴桃根癌病菌LAMP引物设计与筛选的结果表明,引物组48-Lamp和9-Lamp具有良好的特异性,两对引物组均可扩增出A.fabacearum,而对其他菌株均无扩增作用。通过荧光目视和琼脂糖凝胶电泳法对引物组48-Lamp和9-Lamp的灵敏度进行检测,结果显示9-Lamp引物组具有较高的灵敏度,基因组DNA最低检测下限为5×10-8 ng/μL。将引物组48-Lamp和9-Lamp检测体系应用于猕猴桃组织和土壤的基因组DNA检测,发病的土壤和组织均能进行LAMP扩增,荧光目视检测结果呈阳性,健康土壤与组织无LAMP扩增反应。本研究通过分离鉴定明确猕猴桃根癌病的病原菌种类,结合比较基因组建立具有特异性、高效的PCR检测技术及简便、特异、灵敏度高的LAMP检测技术,实现对猕猴桃根癌病的分子检测。通过建立猕猴桃根癌病的分子检测体系,为该病害的早期诊断提供技术支撑,有利于及时、科学、有效防治猕猴桃根癌病和减少经济损失具有重要的指导意义。
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