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目的探究予以外源性鼠源r-GDF11及AAV转染主动脉下调GDF11表达对C57BL-6小鼠动脉血管钙化进程的影响;探究GDF11是否通过Smad2/3信号通路影响C57BL-6小鼠动脉钙化。方法1.C57BL-6小鼠动脉钙化模型的建立:实验采用12周龄C57BL-6雄性小鼠,适应性饲养1周后,予以维生素D3(Vit D3)·无水乙醇溶液肌注、尼古丁·花生油悬浊液灌胃,分别饲养3、5、7、9周,通过Von Kossa-苏木素-伊红染色观察并比较4组中主动脉弹性纤维断裂情况、血管内膜及中膜钙化程度,免疫组化观察钙化标志蛋白BMP2、RUNX2分布情况,从而建立起成熟、稳定的时长依赖的C57BL-6小鼠钙化梯度模型。2.腹腔注射外源性鼠源r-GDF11,观察上调GDF11对C57BL-6小鼠动脉血管钙化进程的影响:取5周龄C57BL-6小鼠30只,随机均分成5组,适应性饲养1周后,分别每天予以腹腔注射生理盐水、溶媒缓冲液、低浓度外源重组小鼠源GDF11(r-GDF11),中浓度r-GDF11,高浓度r-GDF11,预处理7周,之后诱导钙化7周,眼球采血后分离其主动脉,观察并比较5组之间Von kossa-HE染色的钙盐沉积程度及主动脉弹性纤维断裂情况、Western Blot检测钙化标志蛋白BMP2、RUNX2、GDF11在动脉血管内的含量,免疫组化检测钙化标志蛋白BMP2、RUNX2、GDF11的分布。3.AAV转染主动脉下调GDF11表达,观察下调GDF11对C57BL-6小鼠动脉血管钙化进程的影响:取11周龄C57BL-6小鼠18只,随机均分成3组,适应性饲养1周后,空白组尾静脉注射生理盐水、对照组尾静脉注射空病毒、实验组尾静脉注射包装好的AAV,1周后PCR法观察AAV转染是否成功,成功后诱导小鼠主动脉钙化3周。之后眼球采血后分离其主动脉,观察并比较3组之间Von kossa-HE染色的钙盐沉积程度及弹力纤维断裂情况、Western Blot检测钙化标志蛋白BMP2、RUNX2、GDF11在动脉血管内的含量,免疫组化钙化标志蛋白BMP2、RUNX2、GDF11的分布。4.将实验第一部分上调及下调GDF11的主动脉蛋白低温融化,行Western Blot检测,观察钙化标志蛋白BMP2、RUNX2,以及GDF11、p-Smad2/3、Smad2/3的表达。5.取11周龄C57BL-6小鼠18只,随机均分成3组,适应性饲养1周,空白组、对照组注射生理盐水,实验组注射Smad2/3抑制剂,1周后,诱导钙化3周,之后眼球采血、分离其主动脉,观察并比较3组之间Von kossa-HE染色的钙盐沉积程度及弹力纤维断裂情况、Western Blot检测钙化标志蛋白BMP2、RUNX2、GDF11、Smad2/3、p-Smad2/3在动脉血管内的含量。结果1.C57BL-6小鼠动脉钙化模型的建立:Von kossa-HE中,3周组血管几乎未见钙化,5周组中内膜可见黑褐色钙盐沉积,但中膜弹力纤维连续性完整,7周组与9周组血管内膜较前两组黑褐色钙盐沉积明显增多,且中膜弹力纤维断裂明显,无连续性;免疫组化中,3周组、5周组、7周及9周组钙化标志蛋白BMP2、RUNX2、GDF11逐渐密集,7周组与9周组之间BMP2、RUNX2分布光镜下无明显差别。2.腹腔注射r-GDF11后诱导钙化:Von kossa-HE中,低、中、高浓度r-GDF11组较空白组及溶媒组钙盐沉积减少,弹力纤维更为完整,且r-GDF11浓度越高,钙盐沉积越少,弹力纤维越完整;Western Blot中,低、中、高r-GDF11浓度组的钙化标志蛋白BMP2、RUNX2较空白组及溶媒组表达降低,r-GDF11浓度越高,钙化标志蛋白表达越低(各组间P<0.05);免疫组化中,r-GDF11浓度越高,动脉组织中GDF11越密集,钙化标志蛋白RUNX2、BMP2越稀疏。3.AAV转染小鼠主动脉下调GDF11后诱导钙化:Von kossa-HE中,空白组及对照组动脉内膜光滑,中膜弹力纤维完整,未见钙盐沉积,而实验组内膜欠光滑,中膜弹力纤维可见断裂,且中膜可见黑褐色钙盐沉积;Western Blot中,钙化标志蛋白BMP2、RUNX2在实验组表达较空白组及对照组表达明显增加,而GDF11表达则明显减少(与空白组相比较,P<0.05);免疫组化中,钙化标志蛋白BMP2、RUNX2分布在实验组中较空白组及对照组更为密集,而GDF11则更加稀疏。4.上调组中,p-Smad2/3在低、中、高浓度GDF11组表达依次升高,且GDF11浓度越高、p-Smad2/3表达越高,动脉钙化程度越低(各组间P<0.05);下调组中,p-Smad2/3在GDF11下调组较空白组及对照组表达更低,动脉钙化程度更高。5.Von Kossa-HE染色中,实验组较对照组,内膜欠光滑,中膜内有黑褐色钙盐沉积,且中膜已有弹力纤维断裂;Western Blot中,实验组较对照组,钙化标志蛋白BMP2及RUNX2表达更多,GDF11表达更少,p-Smad2/3表达更少(P<0.05);结论GDF11可以影响C57BL-6小鼠动脉钙化:上调GDF11可减轻动脉钙化程度;下调GDF11可加重动脉钙化程度;GDF11通过磷酸化Smad2/3抑制C57BL-6小鼠动脉钙化。