论文部分内容阅读
目的: 探索凉膈散治疗脓毒症大鼠的最佳剂量及对脓毒症大鼠血清炎性因子和组织凋亡蛋白的影响,初步揭示凉膈散治疗脓毒症的免疫学机制,为指导临床,开发新的治疗脓毒症的药物提供实验依据。 方法: 1、选择健康Wistar雄性大鼠120只,按随机数字表法分为中药治疗组(n=90)、CLP模型组(A组,n=30),中药治疗组根据中药中高低剂量随机分为B、C、D3组(n=30)。采用盲肠结扎穿孔法(CLP)制备大鼠脓毒症模型。CLP模型复制成功,大鼠苏醒后2小时分别经口灌胃给予蒸馏水(A组),凉膈散3.9g/kg.d(B组),凉膈散7.8g/kg.d(C组),凉膈散15.6g/kg.d(D组),每次1ml/100g,间隔12h,每日2次。观察记录大鼠术后一周的死亡率,确定凉膈散治疗脓毒症大鼠的最佳剂量。 2、选择健康 Wistar雄性大鼠220只,按随机数字表法分为正常组(n=10)、sham组(n=30)、中药治疗组(n=90)、CLP模型组(n=90)。sham组、中药治疗组、CLP模型组根据不同时间点(24h、48 h及72h)随机分为3个亚组。采用盲肠结扎穿孔法(CLP)制备大鼠脓毒症模型,CLP模型复制成功,中药治疗组于大鼠苏醒后2小时经口灌胃给予凉膈散7.8g/kg.d,每次1ml/100g,间隔12h,每日2次。sham组与CLP模型组同理给予等量的蒸馏水灌胃。术后根据不同时间点大鼠腹主动脉取血并取肺、肝、肾、脾组织。大鼠动脉血离心取上清,采用 ELISA法检测脓毒症大鼠血中炎性因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10)的水平。HE染色观察脓毒症大鼠肺、肝、肾、脾组织的组织细胞形态学改变。免疫组织化学法观察脓毒症大鼠肺、肝、肾、脾组织凋亡蛋白Bax、Bcl-2的表达,并进行统计分析。 结果: 1、 A组(CLP模型组)大鼠在24 h、48 h、72 h、168h存活率分别为73.3%,46.7%,36.7%,33.3%;中药中药治疗组B组(低剂量)在24 h、48 h、72 h、168h存活率分别为73.3%,53.3%,46.7%,46.7%;C组(中剂量)在24 h、48 h、72 h、168h存活率分别为76.7%,63.3%,60%,60%;D组(高剂量)在24 h、48 h、72 h、168h存活率分别为70.3%,50.3%,43.3%,43.3%;中药中药治疗组能明显提高脓毒症大鼠术后一周存活率,以中剂量(7.8g/kg.d)效果最好,差异有统计学意义(P=0.038)。存活大鼠较模型大鼠精神状态好,活动增多,皮毛光滑润泽。 2、TNF-α:TNF-α水平在CLP术后24 h时达到峰值,中药治疗组24h、48h与CLP模型组24h、48h比较,中药治疗组低于CLP模型组,差异有统计学意义(均 P<0.05)。IL-1β:IL-1β在CLP术后24 h时达高峰,随后逐渐降低,中药治疗组24h与CLP模型组24h比较,中药治疗组低于CLP模型组,差异有统计学意义(P=0.000)。IL-6:IL-6呈先升高后降低趋势,48h达峰值。中药治疗组24h、72h与CLP模型组24h、72h比较,中药治疗组低于CLP模型组,差异有统计学意义(均 P<0.05)。IL-10:中药治疗组24h、72h与CLP模型组24h、72h比较,中药治疗组高于CLP模型组,差异有统计学意义(均 P<0.05)。 3、正常组和sham组大鼠腹部平软,腹压正常,剖腹后腹腔内无渗液,盲肠正常,色红,无肿胀、粘连,各组织器官正常;CLP组腹部胀满,腹腔压力高,腹腔内渗液较多,色黄,质稠,恶臭,存在肠粘连和水肿、坏死,部分包裹。中药中药治疗组部分大鼠腹腔内有渗液,色黄,质清,臭味,肠水肿程度较CLP组轻,轻度粘连。 4、HE染色:肺组织:CLP模型组肺泡壁增厚,部分肺泡腔内有纤维素性渗出物和红细胞,纤维素网中可见少量巨噬细胞;部分肺泡腔萎缩,导致部分肺泡腔代偿性扩张。中药治疗组在肺泡腔内也能见到少量的纤维素性渗出物和巨噬细胞,肺泡形态大致正常。肾组织:CLP模型组部分肾小球系膜基质增加,部分系膜细胞增生,肾小管结构模糊,肾小管区大量炎性细胞浸润,部分肾小管细胞肿胀,空泡变性等改变,造模后72h尤为明显。中药治疗组上述变化较CLP模型组轻。脾组织:CLP模型组脾小体体积增大,红髓部大量炎性细胞浸润。中药治疗组脾小体体积增大,红髓部少量炎性细胞浸润。肝组织:CLP模型组肝窦及中央静脉充血、出血,肝窦扩张,大量炎细胞浸润,肝细胞气球样变、点状坏死,随造模时间延长逐渐加重。中药治疗组可见肝细胞气球样变,炎细胞浸润,但较CLP模型组明显减轻。 5、免疫组化染色:肺组织Bax的表达:中药治疗组各时间段均低于CLP模型组,24h和72h差异有统计学意义(P=0.000);肺组织 Bcl-2的的表达,中药治疗组各时间段均高于CLP模型组,24h和48h差异有统计学意义(P=0.000);Bcl-2/Bax比值在24h、48h、72h均高于CLP模型组,差异有统计学意义(P=0.000)。肾组织Bax的表达:中药治疗组48h低于CLP模型组,差异有统计学意义(P=0.002);肾组织 Bcl-2的的表达:中药治疗组各时间段均高于CLP模型组,差异有统计学意义(P=0.002);Bcl-2/Bax比值在各时间段均高于CLP模型组,48h差异有统计学意义(P=0.001)。脾组织Bax的表达:中药治疗组各时间段均低于CLP模型组,差异有统计学意义(P=0.000);脾组织 Bcl-2的的表达:中药治疗组24h、72h高于CLP模型组,差异有统计学意义(P=0.002);Bcl-2/Bax比值在各时间段均高于CLP模型组,差异有统计学意义(P=0.000)。 结论: 1、中药凉膈散能降低脓毒症大鼠术后一周的死亡率,以7.8g/kg.d这一剂量效果最佳。 2、凉膈散能降低脓毒症大鼠24 h和48 h血清 TNF-α的水平。凉膈散能降低脓毒症大鼠24 h血清 IL-1β、IL-6的水平。凉膈散能提高脓毒症大鼠术后24 h和72 h血清IL-10的水平。 3、凉膈散能上调脓毒症大鼠肺、脾、肾组织Bcl-2的表达,下调Bax的表达,使BCL-2/Bax比值增加,减少细胞凋亡,对组织器官起保护作用,对肺脏的保护作用优于脾和肾。