结直肠癌(CRC)在男性和女性肿瘤患者中的发病率分别居于第三和第二位,约30%的病人接受手术治疗后,仍会发生转移。由此,进一步研究结直肠癌发生发展的分子机制,提出更加有效的治疗方法十分必要。研究证明,HGF/c-Met通路与结直肠癌的发生与发展密切相关。HGF是一种在细胞增殖、存活、运动和形态中有重要作用的多效性生长因子,由间质细胞分泌,是酪氨酸激酶c-Met的特异性配体。c-Met表达于各种类型上皮细胞、内皮细胞、原始造血细胞等细胞的表面。HGF/c-Met通路主要与胚胎形成、器官形成、成人的组织修复以及肿瘤,尤其实体性肿瘤密切相关。在c-Met过表达的几种肿瘤细胞包括结直肠癌细胞中,c-Met与其特异性配体结合后促进信号级联,介导了细胞的增殖、抗凋亡功能,细胞的离散以及肿瘤细胞的迁移、侵袭和转移。相关临床研究证明,经单因素分析发现HGF和c-Met均为阳性的结直肠癌患者,平均生存期更短。因此这种特异性配体受体结合关系,使HGF/c-Met通路成为研究抗肿瘤治疗的理想靶点。SMAD4是TGF-信号通路的重要组成部分。研究表明,SMAD4在与免疫系统、基质、上皮的相互作用中起到重要而复杂的作用,而阻断SMAD4的表达,可促进结直肠癌的发生。并且SMAD4的缺失与晚期结直肠癌及其转移有关。临床研究证实,在家族性青少年息肉病(FJP)患者中已经鉴定出SMAD4和BMPR1A基因的突变,并且约占FJP病例的50%。SMAD4缺失除了增加发生结直肠癌的风险之外,在散发性CRC中也发现有高比例的SMAD4突变。且在具有微卫星不稳定性(MSI)和染色体不稳定性的肿瘤中,也有SMAD4突变的发现。因此,SMAD4是结直肠癌研究中的重要靶基因之一。据文献报道,HGF能转录介导抗凋亡蛋白Mcl-1的表达,相反,HGF不会改变Bcl-2及Bcl-x L的表达水平。Mcl-1属于Bcl-2抗凋亡蛋白家族的一员,可作为上游分子调控凋亡,通过线粒体释放细胞色素C等一系列级联事件来进行早期干预从而促进细胞存活。并且在几种类型肿瘤中,Bcl-2和Mcl-1蛋白的表达水平上调被视为发生抗失巢凋亡。新近研究表明,失巢凋亡的破坏对恶性乳腺癌和结直肠癌有显著的促进作用。并且,Mcl-1稳定表达和抑制Bim表达可作为抑制肿瘤细胞失巢凋亡的关键事件。此前的研究中,多为研究单一因素变化对肿瘤细胞的作用,本研究探讨在SMAD4突变的背景下,HGF诱导Mcl-1表达情况的分子机制,及Mcl-1的表达情况与失巢凋亡的相关性。研究证明,根据细胞类型的不同,HGF可能通过ERK、Akt或STAT信号通路调控Mcl-1的表达,且有文献报道,失巢凋亡与ERK和Akt信号通路有相关性。因此,我们在此研究基础上探讨HGF在SMAD4缺失的CRC细胞中调控Mcl-1表达的分子机制。基于以上研究和发现,本研究共计收集52例结直肠癌组织及40例癌旁组织,应用免疫组织化学方法检测肿瘤组织及癌旁组织中SAMD4与Mcl-1表达情况。并选取了四种结直肠癌细胞,即SMAD4野生型DLD-1、HCT15细胞,SMAD4突变的SW620、HT-29细胞,鉴定SMAD4的表达情况后,应用慢病毒转染的方法,使SMAD4在SW620、HT-29细胞中过表达,并获得稳定的细胞株。分别在蛋白及基因水平上对HGF诱导Mcl-1的表达水平进行检测,并对其分子机制进行探索。同时,应用24孔细胞失巢凋亡能力检测试剂盒检测HGF的刺激及SMAD4的表达情况对结直肠癌细胞失巢凋亡能力的影响。旨在为预防、延缓结直肠癌发生转移,提供新思路。目的本研究以SMAD4突变为背景,探究HGF在CRC细胞中诱导Mcl-1表达的作用和机制,及其对CRC细胞失巢凋亡能力的影响。方法1.应用免疫组织化学染色的方法,检测SMAD4、Mcl-1蛋白在结直肠癌及癌旁组织中的表达水平;2.应用Western Blot的方法检测,经HGF孵育后四种细胞Mcl-1的表达水平,应用慢病毒转染使SMAD4在SW620和HT29细胞过表达,Western Blot及RT-q PCR鉴定SMAD4表达水平,并检测经HGF刺激后,空载组及过表达组细胞Mcl-1的表达情况;3.应用CBA-080 Cyto Select 24-well Anoikis Assay试剂盒,检测各组细胞失巢凋亡率;4.应用Western Blot方法检测在四种野生型细胞(DLD-1、HCT15、SW620|、HT29)中,HGF诱导ERK、Akt蛋白的磷酸化水平;5.应用Western Blot方法检测转染前后SW620及HT29细胞ERK、Akt蛋白的磷酸化水平,并加入特异性抑制剂U0126、LY294002,检测加入通路抑制剂后Mcl-1的表达情况,由此确定HGF是通过ERK还是Akt信号通路来调控Mcl-1的表达。结果1.SMAD4在细胞胞浆、胞核呈阳性着色,且在癌旁组织中阳性率较高,Mcl-1在细胞胞浆呈阳性着色,且在结直肠癌组织中阳性率较高;2.HGF在表达SMAD4的DLD-1、HCT15细胞中对Mcl-1的表达没有显著影响,在不表达SMAD4的SW620、HT29细胞中能使Mcl-1的表达水平上调。经慢病毒载体转染获得了过表达SMAD4的SW620和HT29稳定细胞系。HGF可诱导空载SW620及HT29细胞中的Mcl-1表达水平上调,对SMAD4过表达的细胞则无显著作用;3.SMAD4缺失的SW620、HT29细胞失巢凋亡率明显降低;4.Western Blot检测发现,在表达SMAD4的DLD-1、HCT15的细胞中,HGF诱导ERK、Akt蛋白磷酸化水平低于SMAD4不表达的SW620、HT29细胞;5.Western Blot检测发现,HGF均能使空载及SMAD4过表达的SW620及HT29细胞的ERK、Akt蛋白磷酸化,且空载细胞的磷酸化水平明显高于SMAD4过表达细胞。野生型SW620和HT29细胞中加入ERK通路特异性抑制剂U0126后ERK通路磷酸化被特异性抑制,Mcl-1不表达,加入Akt通路抑制剂LY294002后Akt通路磷酸化被特异性抑制,而Mcl-1仍表达。结论1.Mcl-1在结直肠癌组织中高表达,癌旁组织中低表达;SMAD4在癌旁组织中高表达,肿瘤组织中低表达;HGF在CRC细胞中诱导Mcl-1的表达受SMAD4表达情况的影响;2.HGF可促进SMAD4缺失的结直肠癌细胞抗失巢凋亡能力增强;3.HGF在SMAD4缺失的结直肠癌细胞中是通过ERK信号通路而不是Akt信号通路来调控Mcl-1的表达。