论文部分内容阅读
背景和目的：IgA肾病(IgA nephropathy, IgAN)是我国乃至世界范围内最常见的原发性肾小球疾病,也是导致终末期肾病的最主要病因。目前临床上对其诊断主要依赖肾活检。多数IgAN是进展性疾病,而肾活检作为有创操作不宜反复进行,因此寻找IgAN无创标志物具有重要意义。本研究通过检测IgAN尿上清蛋白标志物,筛选出有助于IgAN病情诊断的蛋白分子标志物,并与临床病理指标进行相关性分析,明确其临床应用价值。方法：1、采用美国RayBiotech公司RayBio(?) AAH-CYT-G4000-8蛋白芯片检测15例IgAN患者(Lee氏分级IgAN-I-II级、IgAN-III级、IgAN-IV-V级各5例),12例肾小球疾病对照组(Disease Control, DC)患者(微小病变MCD、膜性肾病MN、局灶节段性肾小球硬化FSGS,各4例)和5例健康对照组(NC)组尿上清蛋白标志物,筛选出有助于IgAN病情判断的蛋白分子标志物；利用DAVID数据库对差异蛋白进行GO功能(Gene Ontology)生物过程富集和信号通路分析(KEGG-PATHWAY),选择组间差异显著的蛋白进行下一步实验。2、利用酶联免疫吸附实验(enzyme linked immune-sorbent assay, ELISA)技术对上述筛选的差异蛋白在49例IgAN患者(IgAN-Ⅰ-Ⅱ级8例、IgAN-Ⅲ级31例、IgAN-Ⅳ-Ⅴ级10例)、28例DC组患者(MN组8例、MCD组8例、FSGS组12例)和14例NC组中进行扩大样本验证,进一步明确其对IgAN病情评估的价值。对差异蛋白与临床病理指标进行相关性分析,明确蛋白标志物对病情判断的临床意义。结果：利用蛋白芯片技术筛选IgAN与对照组间尿上清差异蛋白因子,共筛选出IgAN组与MCD组间差异蛋白8个;IgAN组与MN组间差异蛋白16个;IgAN组与NC组间差异蛋白1个。亚组分析显示：IgAN-Ⅰ-Ⅱ级组与MCD组间差异表达的细胞因子6个;IgAN-Ⅰ-Ⅱ级与MN组间差异表达的细胞因子20个;IgAN-Ⅲ级与MN组间差异表达的细胞因子9个;IgAN-Ⅳ-Ⅴ级与NC组间、IgAN-Ⅳ-Ⅴ级与MN组间差异表达的细胞因子各3个；IgAN-Ⅰ-Ⅱ级与NC组间、IgAN-Ⅲ级组与NC组间、IgAN-Ⅰ-Ⅱ级与IgAN-Ⅳ-Ⅴ级间、IgAN-Ⅲ级与IgAN-Ⅳ-Ⅴ 级间差异表达的细胞因子各1个。为后期寻找IgAN特异性蛋白标志物提供来源。利用ELISA技术对部分蛋白因子进行验证,发现IgAN组尿上清E-Cadherin水平显著低于DC组(7.11±4.46 vs 13.92±7.65 ng/ml, p<0.01), IgAN组尿上清E-Cadherin水平显著低于MN组(7.11±4.46 vs 18.02±8.40ng/ml,p<0.01)和FSGS组(7.11±4.46 vs 14.51±8.10ng/ml, p<0.01); IgAN组HER2/ErbB2水平显著低于DC组(121.84±125.95 vs 749.00±684.09 pg/ml, p<0.01), HER2/ErbB2水平显著低于MN组(121.84±125.95 vs 990.22±406.18pg/ml, p<0.01)和MCD组(121.84±125.95 vs 1051.70±928.43 pg/ml, p<0.01); Lyve-1水平显著高于NC组(684.98±223.35 vs 62.12±76.43 pg/ml,p<0.01); angiostatin在IgAN组水平显著高于NC组(255.15±288.43 vs 3.31±5.96ng/ml, p<0.05)但低于DC组(255.15±288.43 vs 499.98±314.24 pg/ml, p<0.01)。进一步分析发现,angiostatin水平显著低于MN组(255.15±288.43 vs 579.47±211.69pg/ml, p<0.01)和MCD组(255.15±288.43 vs 664.56±375.95 ng/ml, p<0.05)。以上指标与临床病理进行相关性分析发现angiostatin水平与SCr (r=0.939, p<0.001)、BUN (r=0.931, p<0.001), Cys C (r=0.923,p<0.001), U-Prot (r=0.784, p<0.001)硬化比例(r=0.718,p<0.001)、新月体比例(r=0.588,p<0.001)均呈正相关,与 eGFR (r=-0.721, p<0.001)呈负相关。另外,angiostatin在IgAN重度组(Lee氏分级IgAN-Ⅳ-Ⅴ级组)的水平显著增高于IgAN-Ⅰ-Ⅱ级组(620.43±271.47 vs107.38±83.37 ng/ml, p<0.01)和IgAN-Ⅲ级组(620.43±271.47 vs 117.89±143.84 ng/ml,p<0.01),且在内皮细胞增殖组表达水平显著高于无内皮细胞增殖组(406.95±336.56 vs 189.41±234.70,p<0.01),节段硬化或粘连组的水平显著高于无节段硬化或粘连组(311.54±338.58 vs 112.51±84.90,p<0.01)。Angiostatin水平随着肾小管萎缩、炎细胞浸润和间质纤维化程度的加重而增高,并且在重度间质病变组的表达显著高于其他组。结论：本研究首先采用蛋白芯片技术检测IgAN尿上清蛋白标志物谱,筛选出可用于IgAN与对照组间具有显著差异的蛋白标志物。对差异蛋白进行进一步验证发现,angiostatin在IgAN组与对照组间表达有显著差异,并与临床、病理指标具有很好相关性。Angiostatin可能是反应IgAN病变程度较特异的指标,可作为重度IgAN特异的分子标志物,但其作用机制及临床应用需要进一步扩大样本再验证。