研究背景 大量的研究表明，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在视网膜新生血管形成过程中起关键作用。VEGF是血管内皮细胞的有丝分裂原，可特异性的作用于血管内皮细胞，促使其分裂、增生。视网膜组织缺血缺氧可上调VEGF的表达从而继发视网膜新生血管。 年龄相关性黄斑变性(aged-related macular degeneration，AMD)是造成50岁以上人群视力障碍的主要原因。其中，渗出型AMD的发生率约占10％，但致盲率却占90％以上。由于脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)的生长，可导致多数患者中心视力丧失。目前，其发病原因尚不清楚。 虽然缺氧还没有被证实与渗出型AMD中CNV的形成有关，但有研究表明，在渗出型AMD患眼视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞内VEGF的表达明显增加。此外，在视网膜下注射VEGF可导致动物眼内脉络膜新生血管生长。而依靠转基因技术，使小鼠RPE高表达VEGF从而诱发CNV的研究结果也证实了VEGF在CNV发生过程中的重要作用。 在缺氧状态下，缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)与VEGF的高表达有关，它是VEGF最主要的转录因子。HIF-1是氧依赖型的转录激活物，与体内新生血管的发生有密切关 第四军医大学博d匕学位论文系。HIF一1由a亚基和p亚基组成。HIF一1。在常氧及缺氧状态下均稳定存在，而H正一1。表达及活性受缺氧诱导。在常氧下，HIF一1。经泛素一蛋白酶途径不断发生水解。而在缺氧状态下，H正一1。稳定表达，并与HIF一1。通过自身的HLH及PAS结构域形成二聚体，即H正一1，从而发挥其特异性转录激活活性。因此，H正一1的活性主要是由HIF一1。决定的。H正一1和低氧反应有关的基因中低氧反应元件(h邓oxia一response elements，HRE)上的H正一l结合位点(H正一lDNA binding site，HBS)结合，介导低氧反应。下调缺氧状态下HIF一1。的表达可抑制HIF一1的形成，从而降低其对VEGF的转录激活，因此，H正一1。有可能成为基因治疗眼内新生血管疾病的靶点。 近几年，细胞内RNA干扰(RNA interference，RNAi)现象被发现。在RNAi过程中，双链RNA(double一stranded RNA，dsRNA)被导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，从而抑制其相应基因的表达。现在，RNAi正在成为特异性基因治疗的有力工具。目的(l)观察AMD患眼脉络膜缺血缺氧与CNV形成的关系。 (2)分析缺氧状态下人RPE细胞H正一1。及VEGF的表达。(3)观察缺氧对培养的人RPE细胞增生的影响，以及蛋白激酶C(P rotein kinaseC，pKC)信号传导通路对缺氧状态下人即E细胞表达VEGF的作用。(4)构建H正一1。siRNA表达载体，检测RNAi在转染RPE细胞内特异性抑制HIF一1。及VEGF表达的作用。方法(l)对12例(24只眼)首诊为萎缩型AMD，在随访中转变为渗出型AMD(14只眼)的眼底荧光素血管造影(九刀dusfluorescenee angiog即hy，FFA)和叫噪青绿血管造影(indoeyaninegreen angiography，ICGA)进行回顾性分析，对比观察CNV形成前后脉络膜循环变化。(2)缺氧环境的建立:在细胞培养液内加入coCI:溶液1 00林M。将人RPE细胞在含有CoCI:的培养液内分别培养0.5、1、2、4、6、12、24h。借助W亡stem blot、RT-PCR及免疫荧光法检测RPE细胞内HIF一1。n1RNA及蛋白的表达。借助免 第四军医大学博d毖学亡之论文疫组化法及酶联免疫吸附实验(enz”e hnkedi~unosothantassay，ELISA)分别检测RPE细胞及其培养液内vEGF蛋白的表达。(3)人RPE细胞在含有CoCI:的培养液内分别培养1、2、3、4、sd后用四甲基偶氮哇蓝[3一(4，5一dimethylthiazole一Zyl)2，5一diphenyltetrazolium bromide，MTT]比色法检测RPE细胞的增生。人RPE细胞在含有CoCI:的培养液内培养48h后，借助嗜银蛋白染色分析其增殖活性。用含有CoC12的培养液培养RPE细胞0.5、48h后，用免疫荧光法检测人RPE细胞内PKC的表达。将1 oonM的PKC激动剂佛波醇一12一豆范酞一13乙酸(phothollZ一m州state13一aeetate，PMA)及1 OllM PKe抑制剂chelerythrine分别加入人RPE细胞培养液，在缺氧状态下分别培养6、12、24h后，用ELISA检测各组RPE细胞中VEGF的表达。(4)合成2对含有针对H丁一lamRNA序列的正反义寡核营酸，退火后与mu6Pro载体在室温下连接，该表达载体分别被命名为mu6pro/si RNAI和mU6pro/siRNAZ。脂质体介导mU6pro/siRNAI和mU6pro/siRNAZ载体及空载体转染人RPE细胞，经G418筛选(浓度为400m留L)14d后，挑选细胞克隆扩大培养。将H正一1。siRNA载体及空载体转染的RPE细胞在含有CoCI:的培养液内培养，用W匕stem blot、Rl下PCR及免疫荧光法检测RPE细胞内HIF一1。mRNA及蛋白的表达情况。用免疫组化法及ELISA分别检测RPE细胞及其培养液内VEGF蛋白的表达。结果(1)24只萎缩型AMD黄斑区脉络膜毛细血管均有局限性灌注不良，14只眼(583%)CNV在原脉络膜灌注不良区域内生成。(2)免疫荧光染色显示，缺氧o.sh时RPE细胞浆内即有绿色荧光出现。随着缺氧时间的延长，