冬虫夏草作为我国名贵的滋补强壮药材之一,是麦角菌科真菌冬虫夏草菌(Cordyceps sinensis(Berk)Sacc.)寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体。具有补肾益肺、止血化痰的功效,在医疗保健领域其价值不断攀升。由于自然条件的限制和近年来过渡采挖,天然冬虫夏草资源日益匮乏,已远远满足不了市场的需求,这种供需矛盾直接导致冬虫夏草药材的销售价格急剧攀升,每公斤达到数十万元。伴随着冬虫夏草价格的上涨,市场上假冒伪劣、以次充好的现象也越来越严重,因此人工发酵虫草菌丝体(菌粉)应运而生。目前发酵虫草菌丝体有5种之多,公认为冬虫夏草无性型菌种的只有中国被毛孢(Hirsutella sinensis)。尽管其他菌种没有被承认或认可,但已成功培育成菌丝体(菌粉)在使用,并已开发成制剂。冬虫夏草与各发酵虫草菌丝体的化学成分和药理药效相似,难免有用发酵虫草菌丝体代替冬虫夏草投料的现象,目前冬虫夏草与各发酵虫草菌丝体的质量控制整体水平较低,缺乏专属性鉴别方法和高灵敏度的检测技术,面对上述质量问题往往束手无策,因此,建立准确性好、灵敏度高、专属性强的鉴别各种发酵虫草菌丝体和天然冬虫夏草的技术和方法迫在眉睫,对保障公众用药安全有效、维护市场公平公正及保护消费者利益必将产生深远的影响。本学位论文围绕冬虫夏草与各发酵虫草菌丝体的化学成分、蛋白类组分及分子生物学的菌种鉴定等分别开展了以下几方面研究工作:1、针对具有药理活性的核苷类成分建立了核苷类成分特征图谱,同时应用SPSS统计分析软件进行了化学模式识别分析,结果发现冬虫夏草药材中核苷类成分含量较低,而各发酵虫草菌丝体中核苷类成分含量均较高,且各成分相对比例不同,聚类分析结果表明:独家生产的菌丝体其特征图谱的一致性较好,而多厂家生产的同一种菌丝体特征图谱一致性较差,不同企业间特征图谱相差较大,说明产品发酵工艺不同,特征图谱也不同。主成分分析表明,影响各样品特征图谱的主要成分有3种,分别为尿苷、鸟苷和腺苷,在此研究基础上建立了 3种主成分的含量测定方法。2、真菌蛋白是一种特殊蛋白,由于菌种的种属差异,导致其真菌蛋白的氨基酸序列必然存在一定的差异。我们采用蛋白酶切技术和液质联用多肽识别技术对各类样品进行研究。首先提取真菌蛋白后,经SDS-PAGE浓缩胶纯化,切胶,洗脱,用胰蛋白酶进行酶解,得到酶解液,进入液质联用色谱,建立6种样品的酶解质谱肽图。结合蛋白组学技术,对所有肽段进行主成分和偏最小二乘因子分析,寻找各样品的特征肽段,结合搜索相关数据库,对特征肽段进行序列鉴定,鉴定了冬虫夏草2个特征肽段及序列,发酵冬虫夏草菌丝体(百令胶囊菌粉)3个特征肽段及序列,人工虫草菌丝体(心肝宝胶囊菌粉)2个特征肽段及序列,发酵虫草菌丝体(金水宝胶囊菌粉)2个特征肽段及序列,虫草被孢菌丝体(至灵胶囊菌粉)1个特征肽段及序列,虫草头孢菌丝体(宁心宝胶囊菌粉)2个特征肽段及序列,建立了基于真菌特征肽段识别的数据库信息系统,为鉴别冬虫夏草与各发酵虫草菌丝体提供依据和方法。3、采用分子生物学技术对各样品的核糖体RNA部分序列片段进行研究。首先考察了文献报道的常用6对引物对各样品的扩增情况,结果表明,ITS、LSU、SSU 3对引物能将样品扩增出单一条带。在此基础上,构建3对引物的样品系统发育树,采用辛普森多样性指数考察3对引物对样品的鉴别(分型)能力,结果ITS序列对虫草属真菌的鉴定能力最好。进一步对冬虫夏草和各发酵虫草菌丝体的ITS片段进行测序,序列剪切、拼接后,采用IDTDNA在线设计特异性的引物和探针,经过多次筛选,得到冬虫夏草(百令胶囊菌粉)1对特异性引物和探针,金水宝胶囊菌粉1对特异性引物和探针,心肝宝胶囊菌粉(宁心宝胶囊菌粉)1对特异性引物和探针,至灵胶囊菌粉1对特异性引物和探针,最终建立了各样品的实时荧光PCR定性鉴别方法。4、针对样品中所含的氨基酸成分,建立了 PITC柱前衍生化-高效液相色谱法同时测定虫草类样品中17种氨基酸成分,并进行了方法学验证,针对不同虫草样品里的主要氨基酸成分进行了讨论,为合理制定冬虫夏草及各发酵虫草菌粉的氨基酸成分定量标准提供了完整的技术支持。本论文的特色与创新之处:1、首次采用蛋白组学技术,对真菌蛋白的酶解肽段进行了研究,寻找到各样品的专属性特征肽段,并进行了肽段序列分析与鉴定,通过合成等手段,建立了测定用的对照物质。2、首次将生物质谱方法应用于冬虫夏草与各发酵虫草菌丝体(菌粉)的药材鉴定,通过冬虫夏草及各发酵虫草菌丝体样品的色谱质谱信息尤其是特征肽段数据信息库的建立,从蛋白水平解决了虫草类药材的鉴别难题。3、首次采用分子生物学技术对冬虫夏草及各发酵虫草菌丝体进行基因研究。探讨了鉴别虫草类真菌的最佳鉴别序列片段,并在此基础上,设计并筛选了特异性引物和探针,优选后建立各样品实时荧光PCR鉴别方法。4、首次建立基于分子水平的虫草类药材鉴别标准。