临床研究表明,糖尿病妊娠时母体持续性的高血糖会导致胚胎出现严重畸形,其中常见且最严重的情形是出现神经管畸形(neural tube defects,NTD)。然而,关于高糖致NTD的实验研究目前无十分理想的动物模型,其发生机理也尚未阐明。因此,本文通过建立一个全新的高糖致NTD模型,深入探讨其内在的分子机制。同时,基于此模型我们研究了内源性小分子活性肽—肌肽(carnosine)对高糖致NTD的干预作用,并进行了深入的机制研究。首先,我们采用鸡胚胎来建立高糖致胚胎NTD的体内模型,并从多方面验证此模型的有效性和准确性。通过向Hamburger-Hamilton(HH)stage 7的鸡胚气室注射一系列浓度的D型葡萄糖(0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mmol/egg)模拟胚胎发育的高糖环境,孵育至第5日,取胚记录死亡率、体重等指标。体式显微镜下检查胚胎发育的外部表征,统计胚胎的NTD发生率。经固定、切片及HE染色后检查胚胎神经管的内部表征。结果显示,高糖导致胚胎死亡率上升、出现发育迟滞以及NTD率的增加,且与高糖浓度呈剂量依赖关系。胚胎神经管畸形的外部表征与临床表现一致,呈现出脑膨出、无脑、小脑等畸形;HE染色显示的内部表征,高糖诱导的神经管畸形主要表现为背侧神经管的闭合失败。为确定上述损伤是通过高糖进入胚胎体内而造成的,我们利用PET/CT-MRI联用技术对气室注射的葡萄糖进行放射性示踪,结果发现外源性添加的葡萄糖被胚胎吸收入体内代谢,且在中枢神经系统有显著分布;组织内葡萄糖浓度检测显示胚胎内的血糖及脑组织内糖含量均随高糖的浓度而增加;利用Real-time PCR检测,发现葡萄糖转运蛋白GLUT1及GLUT3的m RNA水平也在高糖下显著受到抑制。最后我们确定D-Glucose的0.4 mmol/egg为造模有效剂量。此外,考虑到高糖还有可能通过诱导代谢旁引起高渗应激而造起胚胎发育损伤,我们选用缺乏细胞转运蛋白的L-Glucose进行等渗对照实验。结果发现,L-Glucose并不能显著引起NTD的发生,且其造成的胚胎死亡、发育迟缓及组织糖含量变化远不及同剂量的D-Glucose,进一步确定了高糖是引起胚胎发育损伤的根本原因,其伴随的高渗作用只是次要的原因。基于我们建立的高糖诱导鸡胚神经管畸形模型,经过前期筛选,我们发现了内源性小分子活性肽肌肽对该模型具有干预作用。同时我们选用了孕期常用抗NTD的药物叶酸进行了对比实验。在胚胎孵育的第0 h预添加0.1、0.5、1、5、10 nmol/egg的两种药物,24h后(HH stage 7)给予高糖造模继续孵育至第5天,取胚,记录死亡率、胚重。镜检并记录胚胎NTD率;经切片、染色观察内部表征。结果显示,0.1 nnmol/egg以上剂量的肌肽对高糖诱导的胚胎发育损伤有明显恢复作用,胚胎NTD率显著性地降低。对照药物叶酸的恢复作用明显不及肌肽,仅在5 nmol/egg剂量降低了一定的NTD率。胚胎的整体形态及神经管横断切面的HE染色亦显示肌肽能完好地修复神经管闭合缺陷,而叶酸只能部分地修复。检测血糖及GLUT1及3的m RNA水平时发现肌肽能够显著性恢复血糖含量及GLUTs的异常抑制状态,提示肌肽可能通过某种途径提高了细胞的葡萄糖耐量,缓解了胞内高糖的应激状态。相比之下,叶酸对于高血糖及转运蛋白均无明显作用。Pax3蛋白是一种与神经系统发育紧密相关的转录调控因子。其在神经管的发育中参与了脊髓背腹侧模式的形成,通过调控背侧神经元的分化和凋亡而影响神经管的闭合。我们探讨了关键调控因子Pax3是否参与了高糖诱导的NTD及肌肽的修复作用。利用免疫荧光检测孵育了48 h的鸡胚Pax3蛋白的表达分布,结果显示高糖模型组胚胎在神经管闭合失败的同时,Pax3蛋白的较正常组表达明显下降。肌肽显著性地修复了NTD与Pax3蛋白的表达。而叶酸虽然部分地修复了NTD,但对Pax3蛋白无明显作用。为进一步验证叶酸代谢与高糖诱导的NTD的联系,我们还利用了叶酸的拮抗剂甲氨蝶呤(MTX)代替高糖对24 h的鸡胚造模诱导NTD,发现MTX诱导了相似的NTD表征,但其Pax3蛋白表达水平与正常组类似。以上结果进一步证实了由高糖诱导的NTD和与叶酸代谢异常相关的NTD有所不同,而Pax3蛋白的损失则有可能是此类NTD及肌肽特异性修复作用的关键靶点。利用Western blotting检测了3.5日胚龄鸡胚的Pax3蛋白水平的变化也得到了与免疫荧光类似的结果。利用Real-time PCR检测相关基因表达,发现Pax3下游基因Shh、c-MET、Sox10以及NACM等基因在高糖诱导下下调,肌肽能使之恢复,但Pax3基因在高糖诱导下无明显变化。对于Pax3基因与蛋白水平变化的不一致,我们推测可能是由于高糖及肌肽影响了Pax3转录后的某一修饰过程。我们进一步研究了与高糖应激相关的翻译后修饰—O-Glc NAc修饰对Pax3蛋白的影响,探讨此种营养感受调节机制是否参与了高糖诱导的Pax3蛋白降低,以及肌肽对胚胎Pax3蛋白的修复作用机制。我们检测了鸡胚中总蛋白的O-Glc NAc修饰水平以及O-Glc NAc修饰的两种酶OGT与OGA的基因表达,结果均显示高糖能够诱导O-Glc NAc修饰水平的增加,而肌肽对此修饰水平的异常有修复作用。我们进一步利用Co-IP纯化Pax3蛋白,再检测该转录因子的O-Glc NAc修饰水平,显示Pax3蛋白能被O-Glc NAc修饰,且在高糖下该修饰增加,肌肽作用下恢复。利用免疫荧光双标技术及激光共聚焦检测Pax3与O-Glc NAc的共定位,显示正常胚胎中Pax3蛋白与O-Glc NAc修饰共定位于核质连接部位。高糖作用下使Pax3的O-Glc NAc修饰水平增加,肌肽作用下有所恢复。以上结果证明了Pax3蛋白的O-Glc NAc异常增多可能参与了高糖诱导NTD的机制,而这也可能是肌肽修复此发育损伤的作用靶点之一。综上,我们采用鸡胚建立了一个高糖诱导NTD的新模型,深入地探讨了高糖环境下胚胎NTD的形成机制,为研究糖尿病妊娠导致胚胎畸形的分子机制提供了新的理论依据。同时,我们还证明了内源性小分子活性肽—肌肽对高糖诱导的神经管畸形的保护作用,为预防和治疗此类代谢相关的胚胎疾病提供了全新的策略与思路。