论文部分内容阅读
研究背景： 随着经济的发展和人民生活水平的提高，糖尿病患者逐年增多，临床上常见的糖尿病患者的慢性并发症之一是自发性溃疡及创面形成后难愈合。发生在下肢的慢性溃疡通常表现为糖尿病足（diabetic foot, DF），其治疗困难，可导致截肢，给患者、家庭和社会带来了沉重的经济负担。糖尿病创面难愈的原因非常复杂，一般认为是多种内外因素共同作用的结果，但具体的分子机制尚不明确，临床上也缺乏高效经济安全的药物治疗方法。因此，深入研究糖尿病创面难愈的分子机制，为临床提供潜在的药物治疗靶点是临床工作者及科研人员的一项重要课题。 CD100（Semaphorin4D）是Semaphorin家族（脑信号蛋白）中的一员。研究表明，皮肤受损后CD100信号对于正常创面愈合过程非常关键：CD100不仅是创面愈合起始阶段的关键分子，而且发挥促进血管生成作用，无论是离体培养的血管内皮细胞，还是在体内环境中，CD100 都可诱导强有力的血管新生。但是，截至目前，关于CD100和糖尿病慢性创面愈合的关系还未有深入研究。 前期通过初步的临床研究，课题组已发现，糖尿病足患者溃疡组织中CD100表达较急性创面显著降低；且体外试验中通过加入外源性可溶型CD100（sCD100）能够调节人血管内皮细胞的功能。这些研究结果提示，CD100 参与调节糖尿病慢性创面愈合的过程。因此我们推测，CD100 表达或功能失调引起的血管生成障碍是造成糖尿病慢性创面难愈的重要原因，通过补充外源CD100可能通过促进内皮细胞功能恢复及血管生成作用而促进创面愈合。 研究目的： 1、通过研究 CD100 在临床急性创面、慢性创面和正常对照皮肤组织中的表达特征，阐明CD100在创面愈合中的作用及机制。 2、通过给 db/db 小鼠和 CD100-/-小鼠创面模型外源性的补充可溶型 CD100 （sCD100）分子，阐明CD100对糖尿病慢性创面愈合的作用及其机制。 研究方法： 1、采用免疫组化染色法，分析 CD100 分子在临床急性创面、慢性创面及正常组织标本中的表达差异及定位。 2、构建db/db糖尿病小鼠创面模型，外源性的给予重组表达的sCD100，通过大体观察、HE染色，Masson染色、免疫组织化学染色（CD31、CD34、VEGF和 CD68）和Western blot（Col Ⅰ、Col Ⅲ、TNF-α和IL-6）等方法，分析CD100对db/db小鼠创面愈合过程中的创面愈合率、创面愈合质量、胶原重塑、血管形成和炎症反应的作用及其机制。 3、构建CD100-/-小鼠创面模型，外源性的给予sCD100，通过大体观察、HE染色，Masson染色、免疫组织化学染色（CD31、CD34和 CD68）、Western blot（ColⅠ、Col Ⅲ、TNF-α和IL-6）及RT-PCR（PlexinB1、VEGF、TNF-α和IL-1β）等方法，分析CD100对CD100-/-小鼠创面的创面愈合率、创面愈合质量、胶原重塑、血管形成和炎症作用的作用，探讨其对创面愈合的作用机制。 研究结果： 1、CD100分子在人正常皮肤组织中主要表达于表皮，真皮不表达，其中表皮细胞膜和细胞质中均为高表达，而真皮组织中不表达。人急性创面中CD100表达水平 较正常组织明显降低，其中表皮组织胞膜和细胞质中为低表达，真皮组织中也为低表达。人慢性创面中CD100在表皮组织细胞膜和细胞质中均为低表达，而真皮组织CD100表达显著升高，为高表达。 2、外源性的给予sCD100后，与PBS对照组相比，db/db小鼠CD100处理组创面愈合速度加快，创面愈合时间缩短，创面愈合质量（表皮和真皮新生评分、肉芽组织厚度的评分增加）提高，胶原重塑增加（创面组织胶原的密度高及排列整齐，纤维的成熟度较好，Col Ⅰ和Col Ⅲ的表达增高），血管生成增加（大体观察血管数量增多，CD31、CD34、VEGF的表达增多），炎症反应降低（CD68，TNF-α和IL-6的水平均下降）。 3、外源性的给予sCD100后，与PBS对照组及CD100+/-小鼠相比，CD100-/-小鼠CD100处理组创面愈合速度加快，创面愈合时间缩短，创面愈合质量提高（表皮厚度、表皮和真皮新生评分、肉芽组织厚度的评分均增加），胶原的重塑增加（创面组织的胶原密度增加，排列规律整齐，纤维的成熟度较好，ColⅠ和ColⅢ的表达增高），血管生成增加（CD31、CD34 表达升高），炎症反应程度降低（CD68，TNF-α和IL-6的水平下降）；且CD100处理组创面组织中的PlexinB1、VEGF表达明显上调，TNF-α和IL-1β表达下降。与CD100+/-小鼠相比，CD100-/-小鼠PBS对照组创面愈合时间延长，愈合质量下降，胶原重塑减少，血管生成减少、炎性反应程度较重。 研究结论： CD100表达或功能的失调是导致糖尿病创面难愈的重要原因之一。而外源性的给予sCD100后，能通过促进创面胶原的重塑、血管的生成和降低炎症反应，促进糖尿病创面的愈合，这种作用可能是通过其受体PlexinB1介导的。