目的:肠易激综合征（Irritable Bowel Syndrome,IBS）是常见消化道疾病,以脾虚腹泻型IBS（IBS-D）常见。四君子汤是脾虚型IBS-D临床常用方剂,但该方与肠道菌群的直接交互作用机制缺乏研究。本研究拟将脾虚型IBS-D患者肠道菌群与四君子汤共培养,阐释脾虚型IBS-D肠道微生态失调特征,动态揭示IBS-D患者肠道菌群与四君子汤共代谢调控靶点与调控机制。方法:（1）脾虚型IBS-D病例纳入、临床取样。纳入符合脾虚型IBS-D中西医学诊断标准的典型病例,以及健康对照组。用盛有2ml转运液的粪便采集器收集纳入志愿者的粪便约1g,将同组之内每例入组成员的粪便混匀后分装,于-80℃低温冰箱保存备用。（2）四君子汤人肠道菌群体外共培养。分为正常组与IBS-D组采用离体粪便温孵法对样本粪便进行培养。同组每个样本取1g肠道内容物,用生理盐水与培养基进行混合,制得IBS-D与健康人肠菌孵育液。将两组肠菌孵育液分别与四君子汤水煎剂按4:1混合,在37℃（20%CO2、80%N2）的条件下培养,分别培养0、6、12、24、35 h后,取时间窗口样本,在4000g、4℃离心10 min,分装上清液以及保留菌体,存于-80℃冰箱备用。（3）肠道菌群16S rRNA基因测序。采用16S rRNA基因测序平台,分析各组各时间点培养液在门、纲、目、科、属等层次的相对丰度、物种分类树、样品复杂度、样品多样性等特征。（4）四君子汤-肠道菌群共代谢产物分析。采用液质联用LC-MS平台,对各组各时间点培养液的代谢物进行差异代谢物分析、相关性分析与KEGG富集分析。再通过Spearman统计学方法,对差异代谢物和OTUs属水平上相对丰度Top 10物种进行相关性分析,探讨四君子汤与肠道菌群共代谢调控网络。结果:采用最新中西医学诊断标准,纳入脾虚型IBS-D患者5例,以及年龄相近的健康志愿者5例,混合内各成员的粪便样品,完成四君子汤加味与肠菌菌群的共培养,获得0、6、12、24、35 h等时点的培养样品。16S rRNA测序结果揭示,正常组和IBS-D组在门水平上均以厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、拟杆菌门为主;IBS-D组中厚壁菌门丰度低于正常组,而放线菌门、拟杆菌门、变形菌门则高于正常组。在属水平上,两组主要为乳杆菌、链球菌、志贺埃希氏菌、双歧杆菌、梭菌属;IBS-D组中链球菌属丰度低于正常组,而志贺埃希氏菌属则高于正常组。共培养过程中,乳杆菌、双歧杆菌丰度增高,梭菌、志贺氏埃希菌丰度降低,B/E值逐渐增大。物种多样性分析发现,共培养过程中两组的核心菌群均相对稳定。Alpha多样性指数组间差异分析发现,IBS-D组与正常组的物种种类数并无显著性差异（P>0.05）,但正常组的物种均一度显著低于IBS-D组（P<0.05）。Beta多样性分析结果显示,正常组与IBS-D组组内差异小于组间差异;随着培养时间的延长,两组样本间的差异逐渐缩小。同时,经过组间群落结构差异检验,正常组与IBS-D组之间的群落结构差异显著,且组内差异小于组间差异（P<0.05）。通过PCoA分析和NMDS分析均显示,IBS-D组与正常组可以良好地分离,物种结构组成有显著差异。随着培养时间的延长,两组同一时间窗口所采集样品的物种结构差异有逐渐变小的趋势。聚类树分析显示,随着培养时间的延长,两组样本之间的聚类距离逐渐变短,说明四君子汤可以使IBS-D菌群结构逐渐恢复正常状况。组间差异物种T-test分析发现,在门、纲、目、科、属等五个水平上,正常组与IBS-D组均具有显著性差异。在门水平,IBS-D组厚壁菌门丰度低于正常组（P<0.01）,变形菌门高于正常组（P<0.01）。在属水平上,IBS-D组链球菌属、Paeniclostridium丰度低于正常组（P<0.01）,肠杆菌显著高于正常组（P<0.01）。组间差异物种LEf Se分析结果显示,IBS-D组与正常组之间具有显著差异的Biomarkers有16种。基于T检验以及LEf Se分析,发现在汤共培养过程中,正常组变形菌门丰度减少,IBS-D组下降更明显;正常组厚壁菌门略微上升,IBS-D组则上升幅度略大。在目水平,IBS-D组的肠杆菌目丰度下降幅度大于正常组,而梭菌目丰度下降幅度小于正常组。在属水平,正常组志贺氏埃希菌和芽胞梭菌丰度下降,乳杆菌、双歧杆菌丰度逐渐上升;IBS-D组中双歧杆菌上升幅度明显大于正常组,Paeniclostridium、副轮状芽胞杆菌下降幅度小于正常组。以上结果提示,四君子汤对正常组和IBS-D组的肠道菌群结构的调控作用不同。共培养液的代谢物PCA分析发现,正常组与IBS-D组代谢物差异显著,组内差异小于组间差异（P<0.05）。PLS-DA分析之R2和Q2均接近1,说明模型稳定性良好。总共检测出代谢产物在正离子模式有4042种,其中有458种差异代谢物;负离子模式有1247种,其中有166种差异代谢物。富集分析发现涉及KEGG功能的代谢物293种,其中具有显著差异（P<0.05）的代谢途径10条、差异代谢物14种,包括组胺及组氨酸代谢调控过程;组胺、色胺、吗啡参与神经活性配体-受体相互作用过程;组胺、组氨酸、四亚甲基二胺参与蛋白质消化吸;组胺、花生四烯酸参与Fc epsilon RI信号通路;花生四烯酸、组胺参与炎症介质对色氨酸通道的调节作用。分析四君子汤共培养中差异代谢物的动态变化,发现四君子汤可能通过上调肠道组胺及色胺合成,抑制TNF产生与趋化作用,改善IBS-D症状。16S rRNA测序结果与代谢物关联分析发现,Top 20差异代谢物与目水平上相对丰度Top 10物种具有较强的关联性（P≤0.05,相关系数≥0.6）。例如,代谢物Imidafenacin与链球菌负相关,通过抑制膀胱平滑肌收缩而拮抗排尿。代谢物indeloxazine（INN）与链球菌正相关;INN是5-羟色胺和去甲肾上腺素摄取的抑制剂,具有镇痛作用及潜在的抗抑郁特性。大肠埃希菌-志贺菌则与INN呈负相关。据此推测,四君子汤通过促进链球菌增殖（增加INN合成）,抑制大肠埃希菌-志贺菌生长（抑制5-羟色胺和去甲肾上腺素摄取）,对IBS-D症状起到改善作用。此外,四君子汤通过下调Imidafenacin含量而产生利尿作用,利小便而实大便,符合中医思路治泻不利小便非其治也。结论:健脾益气法代表方加味四君子汤通过调控肠道菌群神经递质代谢,调节肠道菌群结构,从而调节IBS-D患者免疫和神经系统功能。