研究背景宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一,在女性恶性肿瘤中,其发病率及死亡率仅次于乳腺癌,近年来其发病年龄呈年轻化的趋势,严重威胁着女性健康[1,2]。宫颈癌是目前人类所有癌症病变中唯一明确病因的肿瘤,近些年来随着HPV疫苗的研制成功及临床应用的推广,在一定程度上推进了宫颈癌的防治,但其发病机制、已感染人群的患癌风险等核心问题仍无定论。p63是近年来发现的转录因子p53家族成员之一,主要分成两大异构体:具有反式激活区的TA异构体和N末端截短的ΔN异构体[3-5]。现研究认为,TA异构体的功能与p53基因相似,能诱导肿瘤细胞凋亡及其细胞周期停滞,ΔN异构体可通过抑制p53基因的功能,发挥致癌基因的作用,进而促进转化细胞的生长[6]。研究表明,p63主要在各种上皮组织的发育、分化和形态发生上起重要作用,对于胚胎形成过程中外胚层的发育具有重要的意义,在肿瘤发生中更多的是致癌作用而不是抑癌作用[6-8]。生理情况下,p63主要存在于各种上皮组织中的增生区,上皮干细胞的增生、生长,生殖道基底细胞的分化和上皮组织的发育、分化和形态发生均具有重要的意义[9-13]。有报道称,在宫颈组织中,p63蛋白主要表达在基底细胞,也表达于转换区的宫颈储备细胞和宫颈非成熟及萎缩鳞状上皮和宫颈上皮内瘤变组织中,尤其以ΔNp63亚型的特异性更明显[14,15]。但是,ΔNp63是否参与宫颈癌的发生发展尚未可知,于是我们通过本课题来研究ΔNp63在宫颈癌中的表达及其相关机制,进而为宫颈癌的诊断及治疗提供新的思路。研究方法1.利用免疫组化技术检测ΔNp63在宫颈组织中的表达情况。2.利用RT-PCR、Western blot检测ΔNp63在宫颈癌细胞系中的表达。3.利用RNAi技术,将特异性的siRNA干扰片段转染进宫颈癌细胞株Caski、Siha中,利用RT-PCR及Western blot技术检测ΔNp63在宫颈癌细胞株中ΔNp63mRNA及蛋白的表达变化情况。同时,利用CCK8检测特异性siRNA下调ΔNp63的表达后,对宫颈癌Caski、Siha细胞增殖的影响;流式细胞仪检测下调ΔNp63的表达后,对宫颈癌Caski、Siha细胞凋亡的影响。4.利用基因表达谱分析及鉴定技术,将表达ΔNp63基因较高的Caski细胞及对ΔNp63下调后的Caski细胞送基因芯片检测,以筛选与ΔNp63相关的基因,并进行验证。研究结果1.免疫组化结果显示,宫颈鳞癌组织中ΔNp63蛋白的阳性染色主要定位于细胞核。在宫颈不同组织中ΔNp63的表达程度各不相同,三组之间表达差异有统计学意义(p﹤0.001)。且ΔNp63的高表达和宫颈癌的FIGO分期及分化程度相关,差异有统计学意义(p=0.005),但与患者的年龄、淋巴结转移无关。2.ΔNp63在不同宫颈癌细胞中的表达情况各不相同。发现在Caski、Siha中的表达较高,在Hela、C33A中的表达较低。CCK8实验显示,干扰ΔNp63表达48h后,可抑制Siha、Caski细胞的增殖;流式细胞术检测细胞凋亡实验显示,干扰ΔNp63表达48h后,可增加Siha、Caski细胞的凋亡。3.选择四株宫颈癌细胞中表达ΔNp63相对最高的Caski细胞作为研究对象,将Caski NC及Caski siRNA细胞进行基因表达谱芯片分析,根据返回数据,得出二者间的差异基因并验证。结论1.ΔNp63蛋白在宫颈癌组织中的表达较高,且与患者的FIGO分期呈正相关,与患者的病理分级呈负相关。但是与患者的年龄、淋巴结转移无关。2.ΔNp63在Siha、Caski细胞中的表达高于Hela及C33A细胞,利用RNAi技术下调Caski、Siha细胞ΔNp63的表达发现,Caski、Siha细胞的增殖下调、凋亡增加。3.基因表达谱分析结果显示,一共有425个差异基因,其中表达上调的基因有260个,表达下调的基因有165个。我们通过分析发现ΔNp63与EGFR、DKK1的表达关系密切,通过RT-PCR、Western blot验证发现ΔNp63下调后,EGFR、DKK1的表达也相应的下调,与芯片分析结果一致。