葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症(Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency, G6PD deficiency)是一种常见的X染色体连锁不完全显性遗传病,在全球范围内G6PD缺乏症的患者有近4亿人,约4.9%的人受累。现普遍认为此病与疟疾的自然选择有关,主要分布在疟疾曾一度流行的赤道附近热带和亚热带地区。在我国,这一遗传性疾病主要分布在我国长江以南地区,呈“南高北低”的趋势,男性发病率高于女性。广东省是G6PD缺乏症的高发区,全省发病率约为3.1%-16.1%。上世纪的研究发现G6PD缺乏症是由基因突变所致。全球至今共报道186种G6PD基因突变类型,在中国人群中发现28种,其中1376G>T、11388G>A和95A>G是我国常见的三种突变,且仅在华人中存在。作为G6PD缺乏症的高发区,我市至今尚未见G6PD缺乏症基因频率、基因突变谱及突变基因构成比等遗传学资料的研究。G6PD广泛存在于人类体细胞内,是磷酸戊糖途径的关键酶,通过提供还原型辅酶II (Nitrate Reductase, NADPH),使氧化型谷胱甘肽(Glutathione Disulfide, GSSG)转化为还原型谷胱甘肽(Glutathione, GSH),保护细胞免受氧化损害。G6PD缺乏可造成NADPH生成不足,细胞中GSH含量降低,导致机体抗氧化能力不足。病毒感染可诱导宿主细胞出现氧化应激(Oxidative Stress),导致细胞结构损伤和功能障碍[2-6]。研究发现,有限的抗氧化能力使G6PD缺陷细胞对病毒的易感性增高,病毒感染G6PD缺陷细胞后会引起明显的氧化应激,该作用导致病毒毒力增强,宿主细胞发生明显的病理改变[7-9]。肠道病毒71型(Entero virus71, EV71)是引起婴幼儿手足口病(Hand,Foot and Mouth Disease, HFMD)的主要病原体之一,与手足口病患儿严重的神经系统并发症密切相关。从以上研究出发,我们推测G6PD缺乏症可能与EV71型手足口病有着密切关系,并可能通过氧化应激途径影响EV71的易感性及致病性。一、中山地区G6PD缺乏症的分子流行病学调查目的和意义G6PD缺乏症是广东省出生缺陷干预工程的五大病种之一,G6PD缺乏症是中山市新生儿疾病筛查的病种之一,于1998年在我市开展,随着筛查技术及筛查网络的不断完善,每年会检出数千名G6PD缺乏症患儿,作为G6PD缺乏症的高发区,我市至今尚未见G6PD缺乏症基因频率、基因突变谱及突变基因构成比等遗传学资料的研究,本课题的开展将填补中山地区在这方面的空白,揭示G6PD缺乏症在本地区的分子流行病学特征。设计和方法在上世纪80年代,杜传书进行了大规模的G6PD缺乏症流行病学调查,结果显示全国G6PD缺乏症基因频率为0～44.83%,其中广东汉族为7.89%,广东δ=0.01,α=0.05,进行样本量估计,至少需要1961例。根据中山市政府2009年公布的中山市24个行政区(18个镇区和6个街道)的人口比例,在2009年6月至2010年2月到我院接受婚前检查的5940例中山市户籍育龄人员中,按行政区人口比例进行分层随机抽样,共抽取样本4105例,其中男性2119例,女性1986例,被检者就诊时均无贫血表现,所有研究对象均在我院的婚检筛查系统建立个人档案,课题全程采用电子化信息管理。本研究建立了从表型到基因型的分子鉴定流程,用Victor2-1420型多标记分析仪定量检测样品中G6PD活性,成人G6PD活性<1300U/L则为阳性,对阳性样品用酚-氯仿法提取基因组DNA,经PCR扩增后利用变性高效液相色谱(Denaturing High Performance Liquid Chromatography, DHPLC)技术进行分析,经DHPLC技术未检测出已知基因突变且表型阳性的样品被送去上海英骏生物技术有限公司进行G6PD基因测序。结果与讨论本次流行病学调查共检出G6PD缺乏者195例,其中男性134例,男性检出率为6.32%,女性61例,女性检出率为3.07%,总检出率为4.75%,男性和女性的G6PD缺乏症检出率有显著差异(X2=23.97,P<0.001),男性高于女性,根据Hardy-Weinbeng定律,X连锁疾病人群发病率等于男性患者频率,中山市G6PD缺乏症基因频率为6.32%。我们从以上195例样品中鉴定出191例有基因突变,4例表型阳性样品未检出突变,其中173例通过DHPLC分析,18例通过基因测序,共检出10种变异类型,分别为1388G>A、1376G>T、95A>G、871G>A、1311C>T、1024C>T、517C>T、592C>T、392G>T、196T>A,其中1376G>T,1388G>A以及95A>G共占76.92%,本次在中山地区发现的517C>T、196T>A均为广东地区首次报道。从本次调查中我们还发现,1388G>A、1376G>T和95A>G这三种基因突变对应G6PD酶的活性水平无显著差异,但半合子的G6PD酶活性明显低于杂合子。通过本次流行病学调查,我们阐明了中山户籍人群G6PD缺乏症的发病率、基因突变谱及表型与基因型的关系,为制订该地区G6PD缺乏症的防控计划提供科学的参考依据,对优生优育、提高人口素质有重要意义。二、G6PD缺乏症与肠道病毒71型手足口病的相关性研究目的和意义肠道病毒71型(Enterovirus71, EV71)是引起婴幼儿手足口病的主要病原体之一,与重症手足口病密切相关。病毒感染机体后可诱导宿主细胞氧化应激并进一步加重感染。G6PD缺乏可造成NADPH生成不足,细胞中GSH含量降低,机体抗氧化能力不足。近年来已有研究发现G6PD缺陷细胞对EV71易感,我们推测G6PD缺乏症可能与EV71感染所致手足口病有着密切关系。目前G6PD缺陷与EV71型手足口病关系的研究报道尚少,本次研究旨在探讨G6PD缺陷对手足口病患儿EV71病毒易感性、感染后病情严重程度的影响,阐明G6PD缺乏症与EV71型手足口病之间的关系。设计和方法鉴于目前常见的G6PD活性检测方法对男性缺乏者敏感,对女性缺乏者存在明显的漏检,故本次研究以男性儿童为研究对象。选取2011年6月至2012年10月我院收治的手足口病男性患儿220例为研究对象,其中145例为普通手足口病(普通组),75例为重症手足口病(重症组)。手足口病诊断标准参照我国卫生部2010年4月21日发布的《手足口病诊疗指南(2010年版)》。本研究的纳入标准为同时满足以下3个条件：①符合手足口病的诊断标准；②经我院实验室检测大便病原学诊断为EV71感染；③病程少于5天。排除标准为以下任一项者：①近3个月内曾输血、溶血；②家长拒绝行G6PD活性、谷胱甘肽(GSH)及丙二醛(Malondialdehyde, MDA)检测。对照组同期在我院体检的132例健康男性儿童。所有研究对象在收住院后24小时内及手足口病恢复期分别采集静脉血用于检测血液中G6PD、GSH及MDA水平。根据急性期G6PD活性测定结果,普通组与重症组分别分为普通(G6PD正常)组、普通(G6PD缺乏)组、重症(G6PD正常)组与重症(G6PD缺乏)组。220例患儿均按照《指南》给予治疗,观察记录重症组患儿的总热程、精神异常时间、肢体抖动持续时间、病理征持续时间及住院天数。结果1.对照组、普通组、重症组中G6PD缺陷者分别为4例、15例、17例,所占比例分别为3.0%、10.34%、22.67%,普通组、重症组G6PD缺陷率均较对照组高(均P<0.05)。2.重症(G6PD缺乏)组患儿总热程为6.35±2.15天,精神异常天数为2.65±0.93天,肢体抖动持续天数为3.09±1.03天,病理征持续时间为1.18±0.53天,住院天数为10.59±2.32天,G6PD活性为524.26±450.61U/L；重症(G6PD正常)组患儿总热程为5.37±1.36天,精神异常天数为1.81±1.62天,肢体抖动持续天数为2.41-1.19天,病理征持续时间为0.66±0.86天,住院天数为8.74±3.04天,G6PD活性为2842.67±665.64U/L。G6PD缺陷患儿总热程、精神异常天数、肢体抖动持续天数、病理征持续天数及住院天数均显著长于G6PD正常者(P<0.05),G6PD缺乏症患儿G6PD活性较G6PD活性正常者显著降低(P<0.001)。3.普通组急性期全血GSH含量为2.70±0.98mg/gHb,血清MDA为3.80±1.10umol/L, G6PD活性为2963.06±988.36U/L；重症组急性期全血GSH含量为2.28±1.51mg/gHb,血清MDA为4.19±1.08umol/L, G6PD活性为2317.16±1157.63U/L；对照组全血GSH含量为3.63±0.65mg/gHb,血清MDA为3.41±0.52umol/L, G6PD活性为3260.26±701.83U/L。急性期普通组和重症组的GSH、G6PD水平均显著低于对照组,MDA水平均显著高于对照组(P<0.05)；重症组的GSH、G6PD水平均显著低于普通组,MDA水平显著高于普通组(P<0.05)。普通组恢复期全血GSH含量为2.63±0.83mg/gHb,血清MDA为3.76±1.09umol/L, G6PD活性为2984.11±972.82U/L;重症组恢复期全血GSH含量为2.41±0.91mg/gHb,血清MDA为3.99±0.91umol/L, G6PD活性为2324.77±1148.04U/L。恢复期普通组与重症组GSH、G6PD水平均比对照组低(P<0.05), MDA水平均较对照组高(P<0.05)；普通组与重症组恢复期GSH、 MDA水平比较均无显著差异(P>0.05),普通组G6PD水平仍显著高于重症组(P<0.05)。4.普通(G6PD正常)组急性期的全血GSH为2.92±0.76mg/gHb,血清MDA为3.62±1.01umol/L, G6PD活性为3242.85±549.26U/L;普通(G6PD正常)组恢复期的全血GSH为2.81±0.48mg/gHb,血清MDA为3.71±1.57umol/L, G6PD活性为3265.18±574.45U/L;普通(G6PD缺乏)组急性期的全血GSH为0.77±0.12mg/gHb,血清MDA为5.37±0.41umol/L, G6PD活性为538.22±490.94U/L；普通(G6PD缺乏)组恢复期的全血GSH为1.08±0.20mg/gHb,血清MDA为4.14±1.19umol/L, G6PD活性为548.18±484.10U/L；重症(G6PD正常)组急性期的全血GSH为2.75±0.84mg/gHb,血清MDA为3.80±0.84umol/L,G6PD活性为2842.67±665.64U/L；重症(G6PD正常)组恢复期的全血GSH为2.78±0.78mg/gHb,血清MDA为3.92±1.14umol/L, G6PD活性为2849.58±665.91U/L；重症(G6PD缺乏)组急性期的全血GSH为0.67±0.13mg/gHb,血清MDA为5.53±0.67umol/L, G6PD活性为524.26±450.61U/L；重症(G6PD缺乏)组恢复期的全血GSH为1.16±0.26mg/gHb,血清MDA为4.24±1.00umol/L,G6PD活性为534.26±440.35U/L。急性期及恢复期普通(G6PD正常)组GSH水平均较普通(G6PD缺乏)组高(P<0.01),重症(G6PD正常)组GSH水平均较重症(G6PD缺乏)组高(P<0.01)。急性期普通(G6PD正常)组MDA水平较普通(G6PD缺乏)组低(P<0.01),重症(G6PD正常)组MDA水平较重症(G6PD缺乏)组低(P<0.01)。在恢复期,普通(G6PD正常)组与普通(G6PD缺乏)组、重症(G6PD正常)组与重症(G6PD缺乏)组MDA水平比较差异均无统计学意义(p>0.05)。普通(G6PD正常)组、重症(G6PD正常)组急性期与恢复期GSH、MDA水平比较差异均无统计学意义(P>0.05),普通(G6PD缺乏)、重症(G6PD缺乏)组恢复期GSH水平均较急性期高(P<0.01),恢复期MDA水平均较急性期低(P<0.01)。以上四组急性期与恢复期G6PD水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。5.急性期普通组GSH水平与G6PD活性呈正相关(r=0.63,P<0.001),MDA与G6PD活性呈负相关(r=-0.51,P<0.001)。急性期重症组GSH水平与G6PD活性呈正相关(r=0.53, P<0.001), MDA与G6PD活性呈负相关(r=-0.57,P<0.001)。恢复期普通组GSH水平与G6PD活性呈正相关(r=0.65,P<0.001),重症组GSH水平与G6PD活性呈正相关(r=0.48,P<0.001),普通组和重症组MDA与G6PD活性均无相关性(P>0.05)。讨论和分析从研究结果可知普通组、重症组G6PD缺陷者所占比例均高于对照组,提示G6PD缺乏可能增加机体对EV71的易感性。本研究中,急性期普通组与重症组GSH、G6PD水平比对照组低,MDA水平较对照组高,提示在EV71感染急性期,机体确实存在氧化应激。进一步分析发现,手足口病患儿GSH、MDA水平均受G6PD活性影响,GSH水平与G6PD活性呈正相关,MDA水平与G6PD活性呈负相关,以上结果提示G6PD缺陷者在EV71感染急性期,由于抗氧化能力不足,可能会出现高水平氧化应激,加重氧化应激损伤。本研究还发现重症组中G6PD缺陷者病情好转需时及住院时间均较G6PD活性正常者长,提示机体氧化应激的程度与患儿病情相符。本研究中, G6PD缺陷患儿恢复期GSH水平较急性期增高,MDA水平较急性期降低,且恢复期GSH水平与G6PD活性呈正相关,MDA水平与G6PD活性无相关性,以上结果提示G6PD缺陷患儿进入手足口病恢复期后,随着氧化应激损伤的减轻,患儿的病情可能随之好转。手足口病患儿急性期与恢复期G6PD水平比较均无显著差异,说明说明G6PD缺陷不因EV71感染而改变,G6PD活性不受EV71感染影响。EV71感染引起重症手足口病的致病机制十分复杂,目前尚未清楚,本次研究结果在临床上提示机体氧化应激反应可能是机制之一。广东省于1989年开始在新生儿中逐步开展G6PD缺乏症筛查,2003年广东省卫生厅制定了《广东省新生儿疾病筛查管理办法》(试行),明确指出G6PD缺乏症为广东省新生儿疾病筛查的病种之一。鉴于本次研究结果,对确诊为G6PD缺乏症的患儿,除了告知避免接触诱发溶血的物质,还需告知其对病毒易感,在手足口病流行季节注意加强防护。检测手足口病患儿G6PD活性,确定其是否存在G6PD缺陷,有助于评估患儿病情转归,警惕发展为重症病例,对指导临床诊疗、观察病情和判断预后具有重要临床意义。